一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法。本发明专利技术通过筛选获得了两条能够特异性与鱼类小清蛋白结合的核酸适配体，每一条均能用于特异性检测样品中的鱼类小清蛋白，两条核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明专利技术针对这两条核酸适配体开发了一种基于SPR技术特异性检测鱼类小清蛋白的方法，操作简单、灵敏度高、有很强的特异性，具有极好的应用前景。

A nucleic acid aptamer, kit and detection method for specific binding of fish albumin

The invention discloses a nucleic acid aptamer, a kit and a detection method specifically binding to fish albumin. The present invention obtains two nucleic acid aptamers that can specifically bind to fish albumin by screening. Each aptamer can be used for specific detection of fish albumin in samples. The nucleotide sequences of two nucleic acid aptamers are shown as SEQ ID No.1 or SEQ ID No.2. The invention develops a method for detecting fish albumin specificity based on SPR technology for the two nucleic acid aptamers. The method has the advantages of simple operation, high sensitivity, strong specificity and excellent application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法。
技术介绍
鱼是常见的八大过敏性食物之一，其中，小清蛋白(parvalbumins，PV)是其主要过敏原，据统计，95％以上的鱼类过敏患者的过敏症状是由小清蛋白引起的。PV的分子量为10～14kD，等电点为3.9～5.5，主要存在于鱼肉的肌浆蛋白部分，不同鱼类的PV之间存在着免疫交叉反应性，表明PV具有很高的氨基酸同源性。酶联免疫吸附法(ELISA)是鱼类小清蛋白的主要检测方法。比如申请公布号为CN102707064A的中国专利技术专利公开了一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，包括以下步骤：1)淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备；2)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备；3)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记；4)鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立；5)待检样品中鱼类小清蛋白的检测。但是ELISA普遍存在假阳性和假阴性的现象。因此专利技术准确、简便、高灵敏度的鱼类小清蛋白痕量检测方法具有重大意义。公开号为CN105911127A的中国专利技术专利公开了一种用毛细管电泳快速检测鱼类小清蛋白的方法，包括如下步骤：(1)提取鱼肌肉中的全蛋白并溶于pH为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，洗脱液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中所得峰面积代入鱼类小清蛋白的标准曲线回归方程中计算得到样品液中鱼类小清蛋白的浓度。这种方法受干扰因素较多，特别是在样品检测时，全蛋白样品中蛋白种类多且杂，容易干扰检测结果的准确性。核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的，能与靶标产生空间结构匹配的高亲和力和特异性结合的一段单链DNA或RNA分子。相对于抗体，核酸适配体具有选择性高、易合成、易修饰和相对稳定等优点。
技术实现思路
本专利技术首次将筛选得到的一对核酸适配体应用于检测鱼类小清蛋白，建立基于核酸适配体的表面等离子共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)的鱼类小清蛋白检测方法。一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体，核苷酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示。本专利技术又提供了一种用于特异性检测鱼类小清蛋白的试剂盒，包含如权利要求1所述的核酸适配体。本专利技术又提供了另一种用于特异性检测鱼类小清蛋白的试剂盒，包含一对特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。上述两条核酸适配体均为筛选到的可以与鱼类小清蛋白特异性结合的，使用其中任意一条核酸适配体即可以用于特异性检测鱼类小清蛋白，但是使用一对核酸适配体时其中的另外一条可以与纳米金结合，起到一个信号放大的作用。使用纳米金结合核酸适配体与单条的核酸适配体和第二条核酸适配体没有纳米金修饰比较时，能够有效提高SPR检测器的信噪比和检测灵敏度。连接一个荧光基团可以检测核酸适配体和小清蛋白的结合情况，但是用SPR和纳米金可以达到更好的检测效果。本专利技术还提供了一种基于SPR的鱼类小清蛋白检测方法，包括以下步骤：(1)将生物素化的第一核酸适配体偶联到空白SPR传感器芯片上获得检测用SPR传感器芯片，(2)使用步骤(1)制备的检测用SPR传感器芯片检测含有已知浓度鱼类小清蛋白的标准样品以及待检测样品，(3)将标准样品的检测结果处理得到标准曲线，将待检测样品的检测结果代入标准曲线中获得待检测样品中的鱼类小清蛋白浓度，其中，所述第一核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示。步骤(1)中，芯片通过EDC/NHS活化后再用亲和素处理，第一核酸适配体生物素化后与芯片孵育。生物素化可以将核酸适配体和芯片连接同时表征核酸适配体和芯片的结合亲和力。优选的，所述的鱼类小清蛋白检测方法，步骤(2)中使用纳米金标记的第二核酸适配体进行信号放大，第二核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.1所示，第二核酸适配体与第一核酸适配体的核苷酸序列不同。也就是说，第一核酸适配体核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，第二核酸适配体核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，或者第一核酸适配体核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，第二核酸适配体核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。最优选的情况为：所述第一核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，第二核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。若待测样品中有鱼类小清蛋白，则通入样品后，鱼类小清蛋白会与标记在SPR传感器芯片上第一核酸适配体进行结合，从而使得SPR传感器芯片表面的重量发生变化，进而引起折射率的变化。然后通入纳米金标记的第二核酸适配体，SPR传感器表面则会产生更大的重量变化，从而使得SPR信号放大，进而提高传感器的灵敏度，达到痕量检测鱼类小清蛋白的目的。上述检测方法中，所述纳米金标记的第二核酸适配体的制备方法包括以下步骤：(1)使用柠檬酸钠还原法制备获得纳米金溶液；(2)将巯基化修饰的第二核酸适配体加入纳米金溶液中，静置，然后分离得到所述纳米金标记的第二核酸适配体。第一核酸适配体的使用浓度为1～2μmoL/L，体积为10～15μL。第二核酸适配体与纳米金结合起到信号放大的作用，如果不用信号放大就相当于只用一条核酸适配体进行检测，检测信号会降低。标准曲线制备时也需要通过纳米金的信号放大。在检测过程中，经过处理的芯片通过样品再通过金标核酸适配体，SPR信号值趋于稳定后用缓冲液进行洗脱。相对于使用针对靶标蛋白的抗体(即常规SPR检测或ELISA检测时使用的二抗)进行信号放大，本专利技术中第二核酸适配体的作用相似，均用于信号放大，但是相比于抗体，适配体有更多的优点：①多元化的靶标分子；②适配体分子小，因其特殊的大小及空间结构，适配体可以在靶标分子的表面或在其内部起作用；③可以更安全高效的通过体外筛选获得，且相对抗体而言，筛选适配体时无需对实验动物进行抗原免疫，且实验过程简单快速无污染；④结构稳定，不易发生突变，较抗体有更好的热稳定性，可以采取很多修饰手段，不影响其结构的稳定性。⑤高特异性及亲和力，可以识别单个碱基的变化；⑥免疫原性小且无毒性，能与多种靶标进行物质高选择性、高特异性结合。本专利技术通过筛选获得了两条能够特异性与鱼类小清蛋白结合的核酸适配体，每一条均能用于特异性检测样品中的鱼类小清蛋白。本专利技术针对这两条核酸适配体开发了一种基于SPR技术特异性检测鱼类小清蛋白的方法，操作简单、灵敏度高、有很强的特异性，具有极好的应用前景。附图说明图1为鱼类全蛋白样品SDS-PAGE电泳检测结果图，其中，泳道M为标准分子量蛋白Marker，标准PV泳道为作为参照的小清蛋白标准品，样品泳道为所提取的鱼类全蛋白样品。图2为筛选获得的两条核酸适配体的二级结构示意图，其中图A为核酸适配体QP7(序列如SEQIDNo.1所示)，图B为核酸适配体QP10(序列如SEQIDNo.2所示)。图3为标准曲线构建结果图。图4为特异性检测结果图。具体实施方式实施例1样品的制备。取2g罗非鱼鱼肉，用液氮研磨成粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示。2.一种用于特异性检测鱼类小清蛋白的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的核酸适配体。3.一种用于特异性检测鱼类小清蛋白的试剂盒，其特征在于，包含一对特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。4.一种基于SPR的鱼类小清蛋白检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物素化的第一核酸适配体偶联到空白SPR传感器芯片上获得检测用SPR传感器芯片，(2)使用步骤(1)制备的检测用SPR传感器芯片检测含有已知浓度鱼类小清蛋白的标准样品以及待检测样品，(3)将标准样品的检测结果处理得到标准曲线，将待检测样品的检测结果代入标准曲线中获得待检测样品中的鱼类小清蛋白浓度，其中，所述第一核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNo...

【专利技术属性】
技术研发人员：王彦波，戚琴芹，傅玲琳，王翀，周瑾茹，王飞飞，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33