用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法技术

本发明专利技术提供一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs‑IF:E/M方法，该方法基于阴性筛选结合阳性富集CTCs，巧妙结合物理及免疫磁珠的方法，利用实验室可及的仪器设备，通过梯度离心、流式细胞阴性分选、免疫共聚焦阳性筛选及EMT性状鉴定等三个主要步骤，实现对人外周血循环肿瘤细胞的最大限度捕获分离及EMT生物学分型鉴定。而且，本发明专利技术方法可良好对接后续各类CTCs生物学特性的检测，为后续在DNA、RNA等层面进一步分析血CTCs的生物学特质提供平台和可能。

NegFACs-IF:E/M Method for Capturing Tumor Cells in Peripheral Blood Circulation

The invention provides a negFACs IF:E/M method for capturing peripheral blood circulating tumor cells. The method is based on negative screening combined with positive enrichment of CTCs, ingeniously combined with physical and immunomagnetic beads, using laboratory available instruments and equipment, through gradient centrifugation, flow cytometric negative sorting, immunoconfocal positive screening. Three main steps, including identification of EMT traits, were taken to achieve maximum capture and isolation of human peripheral blood circulating tumor cells and identification of EMT biological typing. Moreover, the method of the invention can well dock the detection of the biological characteristics of subsequent CTCs, and provide a platform and possibility for further analysis of the biological characteristics of blood CTCs at DNA, RNA and other levels.

【技术实现步骤摘要】
用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法
本专利技术属于医疗检验专利技术
，具体涉及一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，该方法主要用于捕获分离乳腺癌等人外周血中的肿瘤细胞并用于下游分析。
技术介绍
乳腺癌是目前中国乃至全球女性发病率最高的癌症，占总癌症死亡高达10％。近年来，我国乳腺癌的发病率和死亡率仍呈逐年增长的趋势。乳腺癌经过外周血至远处复发转移是导致死亡的主因，30-40％的早期乳腺癌患者会发生血行远处转移，而转移后的5年生存率仅20％左右。循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell，CTCs)是指游行于血液循环系统中的肿瘤细胞，是肿瘤转移的关键细胞群。捕获并分离外周血循环肿瘤细胞并通过下游的分子生物学研究其生物学恶性转移相关的生物学特性，是预防及清除乳腺癌等肿瘤远处血行转移和复发的治疗关键。目前乳腺癌等肿瘤CTCs分离捕获的经典方法主要有两大类：(一)免疫磁珠捕获法：目前临床上对CTCs开展研究主要采用美国的CellSearch设备，CellSearch是免疫磁珠法的典型代表，该法主要利用包被EpCAM(epithelialcelladhesionmolecule,上皮细胞黏附分子，一种表达于上皮型肿瘤细胞表面的分子)抗体的免疫磁珠与CTCs表面EpCAM抗原特异反应实现对CTCs的捕获富集。该法在应用初期确实反映了乳腺癌外周血CTCs与病情进展的显著关联，但由于方法原理依靠EpCAM的抗原-抗体反应，只能识别上皮型CTCs，而无法识别外周血中因EMT-MET(epithelialtomesenchymal-mesenchymaltoepithelialtransition,上皮间质-间质上皮间转化)的动态转化而同样存在的间质型CTCs，尤其是乳腺癌中常见的三阴性乳腺癌亚型间质型CTCs比例可高达80％以上，因而基于EpCAM的免疫磁珠捕获法并不适合乳腺癌等有间质型CTCs存在的肿瘤，而目前的研究认为乳腺癌、肠癌、肺癌等多种肿瘤中均普遍存在间质型CTCs。(二)物理分离法：主要利用CTCs与外周血其他细胞在密度、大小、电离特性等方面的差异进行分离捕获，常见的有微流控分离法等。物理分离法不受EMT-MET表面标志物的影响，但是由于CTCs和白细胞等外周血有核细胞存在一定范围的物理特征的重叠，物理分离的特异性相对较低。而且微流控的方法通常需要借助各类芯片的设计及加工，这些芯片都局限于个别实验室难以进行普遍开展，且芯片的材料及加工价格昂贵，不同芯片之间捕获效率等差异较大，难以广泛开展，因此临床应用还有待于进一步评估。本专利技术“用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法”是基于阴性筛选结合阳性富集以同时特异性分离乳腺癌等肿瘤的上皮型及间质型CTCs，本法基于实验室可及的仪器设备，巧妙地结合了物理和免疫法以捕获分离乳腺癌等人外周血循环肿瘤细胞。优势上能：1)规避物理微流控分离CTCs在芯片等可及性较差的缺点，本法利用的离心、流式分选仪、共聚焦荧光显微镜等都是实验室较为普遍的仪器，利用本专利技术方法的步骤可很好地进行CTCs的分离，且以上各项仪器均是国际上较为成熟普遍应用的仪器，仪器的稳定性可很好地保证本专利技术方法在CTCs细胞分离上结果上的一致性和可重复性；2)本专利技术方法在阴性筛选步骤上利用梯度离心富集含CTCs的单核细胞层后进一步用流式细胞仪最大程度地精确地去除人外周血中的免疫细胞，该两步骤逐层递进，梯度离心可以最大限度富集含CTCs的细胞群，但是鉴于CTCs在外周血中含量极少，且与单核细胞在大小、密度等物理特性上重叠明显，进一步利用外周血单核细胞上共同特征性表达的CD45分子以流式细胞仪进行阴性筛选，剔除单核细胞以最大限度地保留CTCs；3)本专利技术方法中巧妙地利用免疫荧光的步骤同时涵盖了上皮型及间质型CTCs的表面标志物，利用此步骤可最大限度地富集包含上皮型及间质型在内的CTCs，而不是像传统的CellSearch只包含上皮型的CTCs，尤其适用于广泛存在肿瘤细胞EMT-MET转化及间质型CTCs的癌种，通过此法同时可准确地鉴定和区分上皮型和间质型的CTCs，以此基础上可分别进一步分析上皮型、间质型CTCs的生物特征的异同点。因此，本专利技术“用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法”通过阴性筛选和阳性富集，可以大限度地富集包括上皮及间质型在内的外周血CTCs，并能准确鉴定该亚型的CTCs以利于后续的生物学研究。本专利技术“用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法”，该方法应视为一个整体，每个步骤及其组合的整体形成了完整的捕获分离系统，该整体的捕获分离系统国内外尚无报道。
技术实现思路
针对目前乳腺癌等肿瘤CTCs分离捕获的经典方法存在的不足，主要包括：以CellSearch为代表的免疫磁珠捕获法只能捕获上皮型CTCs因而疏漏了大量存在的间质型CTCs，而使捕获的CTCs结果不准确；以微流控等为代表的物理分离法很难规避CTCs与外周血有核细胞在一定范围内物理特征的重叠，同时又局限于芯片等制作工艺复杂造价昂贵的困难。本专利技术提供一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，该方法基于阴性筛选结合阳性富集CTCs，巧妙结合物理及免疫磁珠的方法，利用实验室可及的仪器设备，通过梯度离心、流式细胞阴性分选、免疫共聚焦阳性筛选及EMT性状鉴定等三个主要步骤，实现对人外周血循环肿瘤细胞的最大限度捕获分离及EMT生物学分型鉴定。而且，本专利技术方法可良好对接后续各类CTCs生物学特性的检测，为后续在DNA、RNA等层面进一步分析血CTCs的生物学特质提供平台和可能。本专利技术的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，包括如下步骤：1)采用梯度离心法富集含有CTCs的单核细胞层；2)分离CTCs的富集层进行进一步的流式阴性筛选以去除血细胞；3)采用免疫荧光染色阳性筛选并鉴定包含上皮型、间质型在内的各型CTCs。上述技术方案中，步骤1)的方法具体为：抽取新鲜人外周血于抗凝收集管中，加入PBS溶液进行混匀稀释，将稀释好的外周血连续缓慢注入预先装有Ficoll-Pague淋巴细胞分选液的离心管中，轻放入离心机中，以1040xg,20℃条件进行不间断水平离心15分钟，离心后标本明显分层，由上至下分别为：血浆层，白膜状的包含CTCs的单核细胞层，分离层，底层为红色的红细胞及粒细胞沉淀层，用枪头吸弃血浆层，吸取白膜状的包含CTCs的单核细胞层至新的离心管中，加入PBS溶液，混匀后放入离心机中，以400xg,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，吸弃上清留下底层的细胞沉淀，加入ACK红细胞裂解液裂解5分钟后再加入PBS溶液，放入离心机中，以400xg,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，离心后弃上清，用PBS溶液重悬细胞沉淀，得到富含CTCs的单核细胞层重悬液，冰上保存。步骤2)具体为：取步骤1)中得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液，稀释后进行细胞计数，按1×106cells加入80-100μl的PE-CyTM5MouseAnti-HumanCD45抗体中，室温20℃避光、静置孵育40本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs‑IF:E/M方法，其特征在于，包括如下步骤：1)采用梯度离心法富集含有CTCs的单核细胞层；2)分离CTCs的富集层进行进一步的流式阴性筛选以去除血细胞；3)采用免疫荧光染色阳性筛选并鉴定包含上皮型、间质型在内的各型CTCs。

【技术特征摘要】
1.一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，包括如下步骤：1)采用梯度离心法富集含有CTCs的单核细胞层；2)分离CTCs的富集层进行进一步的流式阴性筛选以去除血细胞；3)采用免疫荧光染色阳性筛选并鉴定包含上皮型、间质型在内的各型CTCs。2.如权利要求1所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，步骤1)的方法具体为：抽取新鲜人外周血于抗凝收集管中，加入PBS溶液进行混匀稀释，将稀释好的外周血连续缓慢注入预先装有Ficoll-Pague淋巴细胞分选液的离心管中，轻放入离心机中，以1040xg,20℃条件进行不间断水平离心15分钟，离心后标本明显分层，由上至下分别为：血浆层，白膜状的包含CTCs的单核细胞层，分离层，底层为红色的红细胞及粒细胞沉淀层，用枪头吸弃血浆层，吸取白膜状的包含CTCs的单核细胞层至新的离心管中，加入PBS溶液，混匀后放入离心机中，以400xg,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，吸弃上清留下底层的细胞沉淀，加入ACK红细胞裂解液裂解5分钟后再加入PBS溶液，放入离心机中，以400xg,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，离心后弃上清，用PBS溶液重悬细胞沉淀，得到富含CTCs的单核细胞层重悬液，冰上保存。3.如权利要求1所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的步骤2)具体为：取步骤1)中得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液，稀释后进行细胞计数，按1×106cells加入80-100μl的PE-CyTM5MouseAnti-HumanCD45抗体中，室温20℃避光、静置孵育40分钟，调试好流式细胞仪，488nm激光于675-20通道收集荧光，先将同型对照重悬液置入流式仪中，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，余下的细胞群按照同型对照荧光强弱进行画门，以同型对照设定CD45阴性的细胞群，而后将实验组重悬液轻度涡旋后，置入流式细胞仪，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，选取同型对照所示的CD45阴性门内的细胞进行回收，收集PE-Cy5CD45阴性的细胞群于收集管中。4.如权利要求3所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的同型对照重悬液为：取骤1)中得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液，用PBS溶液稀释后细胞计数，按1×106cells加入80-100μl的PE-CyTM5MouseIgG1κIsotypeControl同型对照抗体中，室温20℃避光、静置孵育40分钟。5.如权利要求3所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的收集管应用于收集前先加入1ml的胎牛血清加1ml的PBS溶液的稀释液，震荡仪上涡旋收集管至液泡覆盖整个管壁，弃去稀释液，用PBS溶液润洗洗涤后，加入无菌的PBS溶液2ml用于收集流式筛选的细胞。6.如权利要求1所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的步...

【专利技术属性】
技术研发人员：周娇娇，陈益定，陈齐山，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33