一种隐球菌的检测卡、检测盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种隐球菌检测卡，包括胶板，在胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，层析膜和胶板之间设有第二吸水垫，层析膜上设有检测区和质控区，金标垫上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体。采用本发明专利技术的检测卡或检测盒能快速灵敏的检测隐球菌荚膜多糖抗原的存在，明确检测对象是否被隐球菌感染；本发明专利技术的检测卡或检测盒灵敏度高，特异性强，检测速度快，5分钟内即可得出检测结果，操作十分简单。

【技术实现步骤摘要】
一种隐球菌的检测卡、检测盒及其制备方法
本专利技术涉及隐球菌检测
，尤其是一种隐球菌的检测卡、检测盒及其制备方法。
技术介绍
隐球菌广泛分布于自然界环境中，鸽粪是其主要传染源，新型和哥特型隐球菌能引起人类隐球菌病。隐球菌可以感染人体任何组织和脏器，依照临床表现可分为肺隐球菌病、中枢神经系统隐球菌病、皮肤黏膜隐球菌病、骨隐球菌病及内脏隐球菌病五型。隐球菌感染预后差，中枢神经系统隐球菌病致死率高。正常人群的隐球菌感染可能表现为无症状。当机体免疫力低下或受抑制时，病原菌可直接侵入并引起血行传播，故长期使用免疫抑制剂或糖皮质激素的患者、艾滋病、白血病等病人易患本病。据统计，正常人群中隐球菌的感染率约为十万分之一；在免疫抑制患者中，隐球菌感染的发病率约为5-10％；AIDS患者中，感染率可以高达30％。由于世界范围HIV的泛滥，以及皮质激素、侵入性治疗、器官移植、免疫抑制治疗，大剂量使用激素治疗者增多，隐球菌感染的发病率急剧增高。2006年，全世界约957,900例与HIV有关CM病例和624,725例死亡病例，平均死亡率高达6.5％。HIV有关CM病例主要发生于撒哈拉以南非洲地区，南亚和东南亚地区和拉丁美洲，这三个地区死亡率高达55-70％。隐球菌病临床症状本身缺乏特异性，且起病多有隐匿型，及时准确的诊断一直是临床上的难题。目前，隐球菌临床诊断方法主要有影像学、病原学和血清学诊断。影像学检查能清楚的显示病变部位情况，但以墨汁染色涂片法和沙氏培养基培养法为主的病原学诊断，灵敏度低，墨汁法阳性检出率约为55％，且培养法耗时长，不利于早期快速诊断；另外，血液中真菌负荷低，核酸法不适用。隐球菌病患者免疫常受抑制，血清中可测到的抗体不多，诊断抗体阳性率不高，特异性不强，因此，多采用免疫抗原诊断。通常诊断采用新型隐球菌荚膜多糖体抗原，研究表明，使用血清或血浆样品诊断隐球菌抗原，具有优良的敏感性和特异性；尿液和唾液样本为次选。这说明隐球菌的抗原免疫诊断具有现实的临床价值。临床采用诊断方法包括乳胶凝集法、ELISA法和胶体金法。文献研究报道，ELISA法和胶体金法两种方法的检测结果高度一致，但乳胶凝集法灵敏度不及前两者；ELISA法操作时间较长，而且需要酶标仪等专业设备，不适用于现场快速检测，尤其不适用于在疑似感染和高危人群中开展筛查及早期诊断。免疫胶体金技术是一种POCT诊断技术，以胶体金作为显色标志物。胶体金颗粒在弱碱环境下带负电，可与蛋白质分子等带正电基因静电结合，同时不影响其生物特性，从而可以与待检物(抗体、抗原、小分子等)进行特异性结合。从而实现相应待检分子的快速诊断。尤其是胶体金试剂生产成本和检测成本低，尤其适用于对疑似人群开展筛选，可大为降低筛查成本，降低临床死亡率；尤其适合在疑似感染和高危人群中开展筛查及早期诊断。荚膜多糖存在于多种细菌，既是细菌重要的毒力因子，也是细菌重要的保护性抗原。隐球菌荚膜多糖(Glucuronoxylomannan，GXM)抗原可以在疾病早期即在感染患者的体液(如血清、脑脊液)中出现，是一种理想的早期诊断标志。隐球菌早期适当治疗可降低病死率，防止中枢感染发生。因此本病的早期诊断对于预后及减少或避免后遗症的发生尤为重要，尤其是对于降低中枢神经系统隐球菌病的发生率和死亡率具有非常重要的意义。然而，隐球菌起病隐匿，无明显特征，特别是其早期，容易与其它疾病相混淆。因此，在疑似感染和高危人群中开展隐球菌感染筛查具有重要意义。相关研究表明，在CD4+≤100细胞/μL的艾滋病毒感染者中开展隐球菌筛查，能提高患者生存率并同时降低综合医疗成本。目前，国内尚无成熟的隐球菌免疫胶体诊断产品。已有的临床注册批准的隐球菌产品仅有3种，且都为ELISA法。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种快速有效的隐球菌检测卡。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，本专利技术提供了一种隐球菌检测卡，包括胶板，在所述胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，所述层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，所述层析膜上设有检测区和质控区，所述金标垫上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体。其中，所述胶板优选为硬质的聚氯乙烯底板；所述层析膜优选为硝酸纤维素膜。优选地，所述检测区包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。应当说明的是，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体优选为鼠源性单克隆抗体，是针对荚膜多糖抗原的不同决定簇，因而可以同时与荚膜多糖抗原特异性结果；所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与荚膜多糖抗原结合的部位是不同的。优选地，所述检测区设于所述样品垫和质控区之间。优选地，所述检测区的靠近所述样品垫的一侧设有检测线，所述检测线上包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体。优选地，所述质控区的靠近所述样品垫的一侧设有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。优选地，所述样品垫或/和金标垫采用预处理缓冲液处理，所述预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种。更优选地，所述预处理缓冲液的浓度为10-100mM。优选地，所述预处理缓冲液中还含有表面活性剂；更优选地，所述表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、TritonX-100、TritonX-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种；更优选地，所述表面活性剂的浓度为5-100g/L。优选地，所述表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、TritonX-100、TritonX-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种。为了使检测卡具有更佳的灵敏度和效果，所述金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列具有增敏作用的组分：蔗糖、葡萄糖、氯化钠、氯化钾和甘氨酸中的任意一种或多种的组合；其中，表面活性剂的浓度优选为3-20g/L，预处理缓冲液的pH优选为7.0-7.6。优选地，所述预处理缓冲液中各组分的浓度为葡萄糖1-4g/L、氯化钠0.1-1g/L、氯化钾0.1-1g/L和甘氨酸1-4g/L。优选地，所述金标垫的预处理方法为：将金标垫在预处理缓冲液中浸泡1-3h后取出，于25-38℃烘干。应当说明的是，所述预处理缓冲液的pH值可采用本领域各种常用的pH调节试剂进行调节。在第二个方面，本专利技术提供了一种隐球菌的检测盒，包括盒体，所述盒体内设有上述的检测卡，所述盒体的表面设有加样孔和观察窗，所述加样孔下方为所述样品垫，所述观察窗的下方为所述层析膜。优选地，所述盒体内设有检测卡卡槽。应当说明的是，本专利技术的检测卡或检测盒可用于定性检测血液/脑脊液样品中的隐球菌荚膜多糖抗原。在第三个方面，本专利技术提供了上述的检测盒的制备方法，包括如下步骤：1)用胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体溶液喷涂金标垫，制备包含抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体的金标垫；2)在检测线上喷涂抗隐球菌荚膜多糖的第二单克隆抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种隐球菌的检测卡，其特征在于，包括胶板，在所述胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，所述层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，所述层析膜上设有检测区和质控区，所述金标垫上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种隐球菌的检测卡，其特征在于，包括胶板，在所述胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，所述层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，所述层析膜上设有检测区和质控区，所述金标垫上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述检测区包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述检测区设于所述样品垫和质控区之间。4.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述检测区的靠近所述样品垫的一侧设有检测线，所述检测线上包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体。5.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述质控区的靠近所述样品垫的一侧设有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。6.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫或/和金标垫采用预处理缓冲液处理，所述预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘灵辉，赖演媚，赖柔贝，罗晓锋，
申请(专利权)人：广州爱康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44