一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法技术

本发明专利技术提供了一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法，属工业生物技术领域。本发明专利技术公开之方法特征为，整个分析过程分为电泳、酶谱分析、蛋白谱分析三部分。电泳所用需为无浓缩胶的连续梯度非变性胶，酶谱分析采用off‑on型探针底物，蛋白谱分析可采用考马斯亮蓝染色或银染。本方法一次电泳同时采集到一块胶的酶谱和蛋白谱信息，可快速高效地判断微生物发酵液上清中是否有多酶复合物产生，用于筛选能够产生类纤维小体复合物的微生物菌株，继而开发和用于工业生物转化、生物能源、医药中间体制备等领域。

An Enzymographic Analysis Method for Hemifibrillar Analogues

The present invention provides an enzymographic analysis method for hemifibrous body analogues, which belongs to the field of industrial biotechnology. The method of the invention is characterized by that the whole analysis process is divided into three parts: electrophoresis, enzyme spectrum analysis and protein spectrum analysis. Continuous gradient non-denaturing gum without concentrated gum was used for electrophoresis. Off-on probe substrates were used for enzymographic analysis. Coomassie brilliant blue staining or silver staining were used for protein spectrum analysis. This method can quickly and efficiently determine whether there are multiple enzyme complexes in the supernatant of microbial fermentation broth. It can be used to screen microbial strains capable of producing fibrillar-like body complexes. It is then developed and used in industrial biotransformation, bioenergy and medicine. System preparation and other fields.

【技术实现步骤摘要】
一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法
本专利技术涉及一种针对纤维小体类似物的酶谱分析方法，属工业生物

技术介绍
酶谱法是一种通过底物降解转化来研究水解酶的一种实验技术。酶谱法于1962年推出，当时Gross和Lapière开发了一种检测蝌蚪组织中胶原降解的测定方法，并首次描述了基质金属蛋白酶。通过酶谱分析，可以直观地显示底物通过水解转化为反应产物，通过对反应产物的外观或底物消失具有特异性的检测方法来标记生物化学反应。因此，酶谱分析技术可以用于开发针对任何底物的水解酶：蛋白质和肽，寡糖和多糖，脂质甚至核酸。任何种类的生物样品都可以使用三种中的一种来分析，包括细胞或组织提取物、细胞或组织分泌物，培养液、全血、血浆、血清和其他复杂的身体或灌洗液、组织切片和整个有机体。与用于底物转化的单一定量试管或微量滴定板检测方法相比，酶谱法产生定量和定性两种信息，例如，关于样品中存在的水解酶的分子量和不同酶或变体形式的存在。与不区分完整分子，复合物和降解产物的酶联免疫吸附测定(ELISA)相比，酶谱法允许研究特定形式的酶。与免疫组织化学(IHC)技术相比，原位和体内酶谱可以观察到局部净活性。针对特定应用存在几种类型的酶谱方法，并且每种类型都产生特定的信息。目前广泛使用的凝胶酶谱法(IGZ)技术于1978年引入，用于研究纤溶酶原激活剂。在IGZ的原始形式(命名覆盖酶谱法或间接酶谱法)中，使用SDS-PAGE凝胶分离含蛋白酶的样品，然后将其覆盖在指示剂凝胶上，从而使底物降解和检测。原位酶谱法(ISZ)是一种可以产生组织切片中活性酶定位信息的技术。在ISZ样品中，酶必须保持活性形式。这意味着必须避免在经典组织化学(和IHC)技术中经常使用的苛刻的固定方法。因此，ISZ通过使用新鲜或冷冻组织切片进行。ISZ优于其他组织化学和IHC技术的优势在于它可以在生物环境中显现内源性酶。体内酶谱法(IVZ)依赖于使用蛋白酶激活的荧光探针。在该技术的早期阶段，底物不是特异性的，仅用于检测广泛的蛋白水解活性。自从开发出含有不同荧光团的更特异性探针以来，它们可以同时检测各种酶。IVZ允许在完整生物体中测定MMP活性模式。IGZ，ISZ和IVZ是互补技术。当正确执行和解释时，它们提供的信息不能通过常规免疫分析或其他技术获得。例如，蛋白酶基因表达数据比普遍认可的信息量少，因为这些酶通常编码为无活性前体并且受到各种形式的翻译后调控。因此，基于活性的分析的开发是非常需要的。在一项早期的筛选计划中，我们从土壤中筛选得到了一株野生型Cellulosimcirobiumcellulans菌株F16，能够产生高效水解DAXPC-7木糖苷键的胞外β-木糖苷酶活性。从菌株F16的发酵液上清中分离出的活性组分Xyl_I是一种具有半纤维素水解能力的多酶复合物，这与文献中所报道的另一种能够水解纤维素和半纤维素的超分子多酶复合物——纤维小体，非常类似。纤维小体，是一种主要由厌氧菌所产生的，能够降解植物细胞壁(纤维素、半纤维素等)的超分子多酶复合物。其分子特征是存在骨架蛋白(scaffoldinprotein)，具有多个cohesin结构域；其他亚基则多为纤维小体酶，具有dockerin结构域。整个蛋白依靠cohesin-dokerin结构域之间强的疏水相互作用力结合在一起，这种结合强度大于109M-1，甚至强于抗原-抗体之间的结合强度。该多酶复合物在生物能源、医药中间转化制备领域有着很大的应用潜力。为高效迅速地筛选和鉴定纤维小体类似物及其产生菌，需要更具针对性的酶谱分析策略。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于，提供一种新的酶谱分析技术，为半纤维小体类似物的高通量筛选提供相关技术手段。本专利技术的技术方案：一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法，步骤如下：(1)电泳电泳所用凝胶为无浓缩胶的连续梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺的质量百分比浓度为2％～30％，电泳条件为80～100V，90～120min。需要注意的是，无浓缩胶的连续梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶中必须加入体积百分比浓度为0.5～5％的甘油，以增强低浓度胶的机械强度，否则点样孔处易形成流体状而使得制胶失败。但是，过高的甘油浓度也会导致胶从模具滑出，导致电泳失败。(2)酶谱分析酶谱分析采用底物降解法，使用的是off-on型荧光探针底物。所述的荧光探针底物优选为是4-MU系列，该系列化合物是一种香豆素母核的探针底物，其中，化合物本身是无荧光的，但是其水解产物MU在紫外光激发下产生可见的蓝光。所以，在电泳结束后，取出凝胶，将其置于含有荧光探针底物的缓冲液中，于20～30℃条件下，孵育5～30min，过程切勿晃动。随后，在荧光探针底物对应波长的紫外灯下观察，并拍照记录。(3)蛋白谱分析蛋白谱分析采用考马斯亮蓝染色或银染。酶谱分析结束后，取出凝胶置于考马斯亮蓝染色液或银染固定液中染色2～3h，然后过夜脱色至背景清晰。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法，一次电泳同时采集到一块胶的酶谱和蛋白谱信息，可快速高效地判断微生物发酵液上清中是否有多酶复合物产生，用于筛选能够产生类纤维小体复合物的微生物菌株，继而开发和用于工业生物转化、生物能源、医药中间体制备等领域。附图说明图1为21个典型菌株发酵液上清的电泳分析与活性染色结果，左图为电泳分析图，右图为活性染色结果图。图2为21个典型菌株发酵液上清的电泳分析与活性染色结果，左图为电泳分析图，右图为活性染色结果图。图3为21个典型菌株发酵液上清的电泳分析与活性染色结果，左图为电泳分析图，右图为活性染色结果图。图4为一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法的技术路线。具体实施方式以下结合附图和技术方案，进一步说明本专利技术的具体实施方式。1.电泳首先利用梯度仪配制质量百分比浓度范围为2％～15％的连续非变性梯度凝胶，配方如表1。表1凝胶配方凝胶配制结束后，开始上样。样品由菌株F16发酵液经离心得到的上清液和非变性电泳用LoadingBuffer组成。然后开始电泳，条件为80V，120min。2.酶谱分析电泳结束后，将胶放入含有0.5mMMUX和1mMCaCl2的50mMpH7.5Tris-HCl缓冲液中，30℃孵育5min。随后，迅速将凝胶放到365nm的紫外灯光下观察，并拍照记录。3.蛋白谱分析将上述用于酶谱分析的凝胶继续用CoomassieBrilliantBlueR-250进行染色2h，然后过夜脱色至背景清晰，进行扫描。两张图一个作为非变性的蛋白成分分析图，另一个作为原位的活性分析和对比图。4.结果解读对于21个菌株的发酵液上清所进行的活性电泳结果显示(见图1～3)，产生DAXP水解活性的8个菌株同时也产生类似于菌株F16所产生的那种超分子多酶复合物。其他菌株未检测到超分子酶的产生。即，纤维单孢菌科(Cellulomonadaceae)的绝大部分成员都能够产生胞外的DAXPC-7木糖苷水解活力，以及类似Xyl_I的那种超分子多酶复合物。但原小单孢菌科(Promicromonosporaceae)的成员中，只有纤维微细菌属(Cellulosimicrobium)的菌株产生该活力及超分子酶。所以，从产生DAXP水解活力以及超分子酶的角度看，这个只有纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法，其特征在于，步骤如下：(1)电泳电泳所用凝胶为无浓缩胶的连续梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺的质量百分比浓度为2％～30％，电泳条件为80～100V，90～120min；无浓缩胶的连续梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶中加入体积百分比浓度为0.5～5％的甘油，以增强低浓度胶的机械强度；(2)酶谱分析酶谱分析采用底物降解法，使用的是off‑on型荧光探针底物；电泳结束后，取出凝胶，将其置于含有off‑on型荧光探针底物的缓冲液中，于20～30℃条件下，孵育5～30min，过程切勿晃动；随后，在off‑on型荧光探针底物对应波长的紫外灯下观察，并拍照记录；(3)蛋白谱分析蛋白谱分析采用考马斯亮蓝染色或银染；酶谱分析结束后，取出凝胶置于考马斯亮蓝染色液或银染固定液中染色2～3h，然后过夜脱色至背景清晰，即得到蛋白谱分析结果。

【技术特征摘要】
1.一种半纤维小体类似物的酶谱分析方法，其特征在于，步骤如下：(1)电泳电泳所用凝胶为无浓缩胶的连续梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺的质量百分比浓度为2％～30％，电泳条件为80～100V，90～120min；无浓缩胶的连续梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶中加入体积百分比浓度为0.5～5％的甘油，以增强低浓度胶的机械强度；(2)酶谱分析酶谱分析采用底物降解法，使用的是off-on型荧光探针底物；电泳结束后，取出凝胶，将其置于含有off-on型荧光探针底物的缓冲液中，于20～30℃条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：窦同意，陈静，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21