一种内膜为正电的聚脂肽囊泡及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种内膜为正电的聚脂肽囊泡及其制备方法与应用，属于高分子材料和应用化学技术领域。本发明专利技术首先，通过NCA开环聚合和脱保护简单制备得到PEG‑b‑PAPA‑b‑PLL三嵌段共聚物制备得到内膜为正电的具有不对称膜结构的聚脂肽囊泡(CLP)；并且通过siRNA与PLL的静电相互作用高效的将siRNA装载到囊泡亲水内腔中，囊泡坚固的壁膜能防止siRNA被降解；装载siPLK1的、肺癌细胞选择性穿膜肽CPP33修饰的囊泡(CPP33‑CLP)对A549肺癌细胞具有良好的靶向性、同时CPP33能帮助siRNA快速逃离内涵体、进入细胞质，产生显著的序列特异性基因沉默效果，在荷原位A549肺癌小鼠体内显示出显著增强的肿瘤抑制效果。该简单、稳定的多功能纳米囊泡平台在癌症的基因治疗方面表现出了很大的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种内膜为正电的聚脂肽囊泡及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种内膜为正电的聚脂肽囊泡及其制备方法与应用，属于高分子材料和应用化学

技术介绍
由小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰疗法对包括癌症在内的各种疾病的治疗中显示出了非常巨大的潜力。然而，siRNA存在体内循环时间短、容易被酶降解、细胞渗透性及内涵体逃逸性能差等缺点。因此，如何将siRNA安全、高效地递送到病灶部位是RNA干扰这一基因疗法临床转化所面临的最大障碍和挑战。为了解决这一难题，科学家们开发了各种纳米载体系统用于siRNA的递送。目前，已有几个聚合物siRNA复合纳米粒进入到临床研究阶段，但是这些纳米体系存在稳定性差，在体内易发生解离等缺陷。而聚合物囊泡是一种具有比胶束和其他纳米复合体更高的稳定性的纳米载体，其巨大的亲水内腔能用于装载siRNA，而其坚固的壁膜则能够将siRNA与外界隔离，起到保护siRNA的作用。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术设计合成了一种不对称的三嵌段聚脂肽及由其制备得到一个内膜为负电的具有不对称膜结构的聚脂肽囊泡用于siRNA药物的安全、稳定、高效包载和靶向递送。本专利技术的第一个目的是提供一种聚脂肽材料，所述聚脂肽材料为聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(L-赖氨酸)(PEG-b-PAPA-b-PLL)，其结构式如下所示：其中，x的取值范围为40–2300，y的取值范围为30–800，z的取值范围为1–500。在本专利技术的一种实施方式中，所述聚脂肽材料还包括在亲水段聚乙二醇的末端修饰特异性靶向分子得到的具有靶向的聚脂肽材料。在本专利技术的一种实施方式中，所述的特异性靶向分子为短肽、小分子靶向分子、抗体、多糖或单糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体还包括抗体片段。在本专利技术的一种实施方式中，所述短肽为序列为cRGDfC的cRGD、序列为cNGQGEQc的cNGQ、序列为CSNIDARAC的CC-9或序列为RLWMRWYSPRTRAYGC的CPP33。在本专利技术的一种实施方式中，所述小分子靶向分子为叶酸或茴香酰胺。本专利技术的第二个目的是提供上述聚脂肽材料的制备方法，包括如下步骤：以聚乙二醇-氨基(PEG-NH2)为大分子引发剂，依次引发2-氨基十六烷酸N-羧基内酸酐(APA-NCA)和ε-苯氧羰基-L-赖氨酸N-羧基内酸酐单体(ZLL-NCA)开环聚合制备得到聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(ε-苯氧羰基-L-赖氨酸)(PEG-b-PAPA-b-PZLL)三嵌段共聚物，然后通过脱保护将苯氧羰基脱去，得到所述聚脂肽材料。在本专利技术的一种实施方式中，PEG的分子量优选5KDa，PAPA的分子量优选11KDa，PAsp的分子量优选2KDa。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：(1)在氮气条件下，将2-氨基十六烷酸-N-羧基内酸酐单体的DMF溶液加入到聚乙二醇-氨基的DMF溶液中反应；(2)向步骤(1)的反应液中加入ε-苯氧羰基-L-赖氨酸N-羧基内酸酐单体继续反应，然后采用冰乙醚进行沉淀，干燥后得到聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(ε-苯氧羰基-L-赖氨酸)；(3)通过脱保护方法将聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(ε-苯氧羰基-L-赖氨酸)中的苄氧羰基脱去，采用冰乙醚进行沉淀，干燥后得到聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(L-赖氨酸)。在本专利技术的一种实施方式中，上述制备方法可表示如下：在本专利技术的一种实施方式中，在步骤(1)中，反应条件为30-40℃反应60-80小时。在本专利技术的一种实施方式中，在步骤(2)中，反应条件为30-40℃反应60-80小时。本专利技术的第三个目的是提供所述聚脂肽材料在基因药物递送中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因药物包括但不限于siRNA、microRNA、mRNA、shRNA、DNA、CRISPR-Cas9。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是将所述聚脂肽材料制备成聚脂肽囊泡进行基因药物送递。本专利技术的第四个目的是提供一种聚脂肽囊泡，由所述聚脂肽材料制备而成，包括由不含靶向分子的聚脂肽材料制备得到，由含靶向分子的聚脂肽材料制备得到，或者在由不含靶向分子的聚脂肽材料制备得到的聚脂肽囊泡表面修饰靶向分子得到。本专利技术的第五个目的是提供所述聚脂肽囊泡在基因药物递送中的应用。本专利技术的有益效果：1、本专利技术制备的聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(L-赖氨酸)，可通过逐步开环聚合及后续的脱保护反应得到。整个制备过程简单直接、可控性好。2、本专利技术公开的聚脂肽囊泡具有尺寸小、稳定性好、siRNA包载量高等特点。3、本专利技术制备方法简单，所用原料来源广泛，重复性好，具有良好的应用前景。附图说明图1是实施例1中的PEG-b-PAPA-b-PZLL的核磁氢谱图；图2是实施例1中的PEG-b-PAPA-b-PLL的核磁氢谱图；图3是实施例2中的Mal-PEG-b-PAPA核磁氢谱图；图4是实施例2中的CPP33-PEG-b-PAPA的核磁氢谱图；图5是实施例3中CPP33-CLP的粒径及其分布图(a)、CPP33-CLP的透射电子显微镜图片(b)、琼脂糖凝胶电泳图(c)；图6是实施例4中Cy5标记的CPP33-CLP(CPP33-CLP-Cy5)在A549肺癌细胞中的细胞流式结果图(a)、不同细胞对CPP33-CLP-Cy5的内吞结果图(b)、经不同细胞内吞抑制剂处理的A549细胞对CPP33-CLP-Cy5的内吞结果图(c)及装载Cy5-siPLK1的CPP33-CLP在A549肺癌细胞中的内涵体逃逸结果图(d)；图7是实施例4中siPLK1-CPP33-CLP在A549细胞内的实时定量聚合酶链锁反应结果图(a)和蛋白印迹结果图(b)；图8是实施例5中Cy5标记的cRGD-CLP在健康小鼠体内的血液循环研究结果图(a)及其在荷A549-Luc原位肺癌小鼠体内的生物分布结果图(b)；图9是实施例6中载siPLK1-CPP33-CLP在荷A549-Luc原位肺癌小鼠体内的抗肿瘤活性结果图，其中a为肿瘤的生长曲线图，b为小鼠的生存曲线，c为小鼠的体重变化图。具体实施方式为了更好地理解专利技术的实质，下面通过实施例来详细说明专利技术的
技术实现思路
。实施例1：聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(L-赖氨酸)(PEG-b-PAPA-b-PLL)三嵌段共聚物的合成PEG-b-PAPA-b-PLL的合成主要包括两个步骤。首先，在氮气条件下、DMF溶液中，以PEG-NH2为大分子引发剂顺序引发2-氨基十六烷酸N-羧基内酸酐单体(APA-NCA)和ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧基内酸酐单体(ZLL-NCA)开环聚合制备得到PEG-b-PAPA-b-PZLL三嵌段共聚物。具体合成步骤如下：在氮气环境下，将15.0mL的APA-NCA(1.04g，3.52mmol)的DMF溶液迅速加到PEG-NH2(0.4g，0.08mmol)的DMF(4.0mL)溶液中；在35℃下反应72小时后，加入第二单体ZLL-NCA(0.44g，1.44mmol)，之后继续反应72小时。反应结束后，将反应液在20倍过量的冰乙醚中多次沉淀，最后抽真空干燥，得到白色固体产物。产率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚脂肽材料，其特征在于，所述聚脂肽材料为聚乙二醇‑b‑聚(2‑氨基十六烷酸)‑b‑聚(L‑赖氨酸)，其结构式如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种聚脂肽材料，其特征在于，所述聚脂肽材料为聚乙二醇-b-聚(2-氨基十六烷酸)-b-聚(L-赖氨酸)，其结构式如下所示：其中，x的取值范围为40–2300，y的取值范围为30–800，z的取值范围为1–500。2.根据权利要求1所述的聚脂肽材料，其特征在于，所述聚脂肽材料在亲水段聚乙二醇的末端修饰有特异性靶向分子。3.根据权利要求2所述的聚脂肽材料，其特征在于，所述的特异性靶向分子为短肽、小分子靶向分子、抗体、多糖或单糖。4.根据权利要求3所述的聚脂肽材料，其特征在于，所述短肽为序列为cRGDfC的cRGD、序列为cNGQGEQc的cNGQ、序列为CSNIDARAC的CC-9或序列为RLWMRWYSPRTRAYGC的CPP33。5.根据权利要求3所述的聚脂肽材料，其特征在于，所述小分子靶向分子为叶酸或茴香酰胺。6.一种权利要求1～5任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓超，邱敏，钟志远，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32