一种快速检测交链孢酚和交链孢酚单甲醚总量的试纸条制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测交链孢酚和交链孢酚单甲醚总量的试纸条，其是利用结构如式(I)所示的半抗原制备的快速检测交链孢毒素(AOH和AME)的免疫层析试纸条，本发明专利技术采用一步间接竞争免疫层析技术开发出可快速定性或半定量检测样品中AOH和AME两种交链孢毒素总含量的免疫层析试纸条，操作简单，经济实用，适合于现场检测，可广泛应用于农产品和食品等样品中AOH和AME两种交链孢毒素污染的检测及快速筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测交链孢酚和交链孢酚单甲醚总量的试纸条
本专利技术涉及食品安全监测和免疫分析检测
，具体地说，涉及一种快速检测交链孢酚和交链孢酚单甲醚总量的试纸条。
技术介绍
交链孢毒素(Alternariatoxins)主要是由交链孢属产生的一系列有毒的次生代谢产物。由于交链孢菌能在低温下生长繁殖，是造成贮运过程中农产品腐败变质的重要原因。目前已发现的有70多种，其中10种对动物和植物具有毒性作用。交链孢酚(Alternariol,AOH)和交链孢酚单甲醚(Alternariolmonomethylether,AME)属于二苯并吡喃酮类毒素，是一类具有致突变性、基因毒性和致癌性等多种毒性的小分子化合物。据报道，河南省林县小麦受交链孢污染严重，且小麦原粮中AOH和AME毒素含量较高，已证明与该地区食管癌高发密切相关。EFSA在2011年和2016年进行两次风险评估结果表明，随膳食摄入的AOH和AME毒素对公众健康存在潜在风险。我国已于2017年将小麦及面粉中交链孢毒素污染列入国家食品污染物及有害因素的监控计划。因此，建立准确、高效的快速检测交链孢毒素的方法进而提高政府监管的时效性是目前亟待解决的关键问题。目前，国内外尚未制定AOH和AME毒素在农产品及食品中的限量标准，其主要采用传统的大型仪器检测方法，如气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联和毛细管电泳等，不仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，已不能满足社会对食品安全监管的需要。免疫分析法主要有酶联免疫分析法和胶体金免疫层析法，具有快速、灵敏、操作简单等优点，近年来获得了快速发展。酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、可定量、对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析试纸条的检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，从而可实现对各种真菌毒素等微量残留物的定性、在线、快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供交链孢毒素半抗原及其制备方法与应用。本专利技术的另一目的是提供一种快速检测交链孢酚和交链孢酚单甲醚总量的试纸条(即一种快速检测交链孢毒素的免疫层析试纸条)及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的交链孢毒素半抗原，其结构如式(I)所示：本专利技术还提供交链孢毒素全抗原，由所述交链孢毒素半抗原与载体蛋白偶联后得到的，即半抗原的羧基与载体蛋白的游离氨基发生缩合反应。其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白等；优选牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)。所述交链孢毒素全抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。其中，所述交链孢毒素单克隆抗体是以交链孢毒素半抗原-载体蛋白偶联物(如交链孢毒素-BSA)作为免疫原，通过免疫试验动物，结合杂交瘤细胞制备技术获得的单抗。优选地，所述单抗的效价为1:810000。采用ELISA法测定所述单抗的效价。ELISA检测效价所用的包被原，其制备方法如下：取交链孢毒素半抗原8mg，加0.2mLDMF溶解，澄清，加入DCC4.13mg，加入NHS2.3mg，室温搅拌2h，过滤，除去沉淀物，得到半抗原活化液A液；取卵清蛋白(OVA)50mg，加8mL0.05mol/LpH7.2PB缓冲液溶解，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温搅拌反应5h。停止反应，0.02MPBS缓冲液透析3d，每天换液三次，得到交链孢毒素-OVA包被抗原，分装，-20℃保存，备用。本专利技术的交链孢毒素半抗原可通过如下方法制备：将交链孢酚70mg溶解到DMF5mL中，加入碳酸钾47mg和溴丁酸甲酯30mg，加热到40℃反应5h；冷却，加入10mL水稀释，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥，减压蒸去溶剂；然后过100-200目硅胶柱进行分离，以CH2Cl2：CH3OH体积比20：1为洗脱剂，得到中间体Ⅰ，其结构如式(II)所示；将中间体Ⅰ45mg溶解到四氢呋喃-甲醇-水7mL中，加入氢氧化钠15mg搅拌过夜；减压蒸去溶剂，加入5mL水稀释，盐酸调pH为5，过滤，干燥即得。其中，四氢呋喃-甲醇-水的体积比为3：3：1。交链孢毒素半抗原合成路线见图1。本专利技术还提供由所述交链孢毒素半抗原，或所述交链孢毒素全抗原，或所述特异性抗体制备的交链孢毒素(交链孢酚、交链孢酚单甲醚)检测试剂或试剂盒。本专利技术还提供所述交链孢毒素半抗原，或所述交链孢毒素全抗原，或所述特异性抗体，或所述检测试剂或试剂盒在交链孢毒素(交链孢酚、交链孢酚单甲醚)的免疫分析检测中的应用。本专利技术还提供所述交链孢毒素半抗原，或所述交链孢毒素全抗原，或所述特异性抗体，或所述检测试剂在制备交链孢毒素(交链孢酚、交链孢酚单甲醚)的胶体金检测试纸条中的应用。本专利技术还提供一种快速检测交链孢酚和交链孢酚单甲醚总量的试纸条(图4)，包括样品垫、胶体金结合垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在底板上。优选地，所述胶体金结合垫1/3～1/2被覆盖于样品垫下。其中，所述胶体金结合垫上包被有交链孢毒素特异性抗体-胶体金标记物，所述交链孢毒素特异性抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体；所述检测线包被有所述交链孢毒素全抗原(例如交链孢毒素半抗原-OVA偶联物)，所述质控线包被有羊抗鼠二抗。所述交链孢毒素特异性抗体-胶体金标记物的制备方法如下：用还原剂将氯金酸还原成胶体金纳米颗粒；将胶体金与交链孢毒素特异性抗体混合孵育30min，加入牛血清白蛋白使其终浓度为1％，反应30min后；离心纯化、浓缩即得交链孢毒素特异性抗体-胶体金标记物。优选地，所述还原剂为1％柠檬酸三纳水溶液。所述胶体金的纳米颗粒大小为13～40nm，更优选为18nm。在本专利技术的一个具体实施方式中，交链孢毒素特异性抗体-胶体金标记物的制备如下：取制备好的粒径大小为18nm的胶体金溶液2mL，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0；随后逐滴加入200μL浓度为20-100μg/mL(优选100μg/mL)的AOH单克隆抗体，室温条件下磁力搅拌反应2h；逐滴加入10％的BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，室温条件下磁力搅拌反应30min；加入10％的PEG20000溶液，并使其终浓度为0.2％，室温条件下磁力搅拌30min；12000rpm离心30min，弃上清，收集胶体金沉淀；沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。其中，所述复溶缓冲液为：0.02％～0.1％酪蛋白(质量分数)、0.05％～0.2％(质量分数)吐温-80、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。优选地，复溶缓冲液为：0.02％酪蛋白(质量分数)、0.05％(质量分数)吐温-80、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫可为吸滤纸或滤油纸；所述胶体金结合垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜。优选地，本专利技术所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.交链孢毒素半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：

【技术特征摘要】
2018.02.12 CN 20181014647111.交链孢毒素半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：2.交链孢毒素全抗原，其特征在于，由权利要求1所述交链孢毒素半抗原与载体蛋白偶联后得到的；其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选牛血清白蛋白、卵清蛋白。3.由权利要求2所述交链孢毒素全抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。4.权利要求1所述交链孢毒素半抗原的制备方法，其特征在于，将交链孢酚70mg溶解到DMF5mL中，加入碳酸钾47mg和溴丁酸甲酯30mg，加热到40℃反应5h；冷却，加入10mL水稀释，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥，减压蒸去溶剂；然后过100-200目硅胶柱进行分离，以CH2Cl2：CH3OH体积比20：1为洗脱剂，得到中间体Ⅰ，其结构如式(II)所示；将中间体Ⅰ45mg溶解到四氢呋喃-甲醇-水7mL中，加入氢氧化钠15mg搅拌过夜；减压蒸去溶剂，加入5mL水稀释，盐酸调pH为5，过滤，干燥即得；其中，四氢呋喃-甲醇-水的体积比为3：3：1；5.由权利要求1所述交链孢毒素半抗原，或权利要求2所述交链孢毒素全抗原，或权利要求3所述特异性抗体制备的交链孢毒素检测试剂或试剂盒，其中所述交链孢毒素选自交链孢酚、交链孢酚单甲醚。6.权利要求1所述交链孢毒素半抗原，或权利要求2所述交链孢毒素全抗原，或权利要求3所述特异性抗体，或权利要求5所述检测试...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蒙，姜冬梅，冯晓元，许文涛，韦迪哲，田晓琴，
申请(专利权)人：北京农业质量标准与检测技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11