一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h；步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉水浴溶解；步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将猪主动脉进行多次冻融；步骤四，将多次冻融后的猪主动脉放置于低浓度去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h；步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h；以及步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉细胞的脱细胞基质，其中，低浓度去污剂缓冲液包括Tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠。

Preparation of porcine aortic acellular matrix*

The invention provides a method for preparing porcine aortic acellular matrix, which comprises the following steps: first, under the vacuum condition, the pig aorta is frozen in a low concentration detergent buffer for 2 to 6h; two, after freezing, the frozen porcine aorta is dissolved in water bath; step three, repeat steps 1 and steps. Two 1~10 times, the pig aorta was subjected to multiple freeze-thaw cycles. Step four, the frozen porcine aorta was placed in a low concentration detergent buffer and treated for 28 to 96h in a 30~50 degree shaking table. Step five, the aseptic deionized water was used to wash the shock of the pig aorta 12 to 48h; and step six, with phosphate. After cleaning the porcine aorta after washing with sterile deionized water for 48 to 96h, the decellularized matrix of porcine aortic cells was obtained. Low concentration detergent solutions included Tris buffer, twelve alkyl sulfate and sodium deoxycholate.

【技术实现步骤摘要】
一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法
本专利技术涉及组织工程领域，具体涉及一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法。
技术介绍
以主动脉瘤、血管夹层、动脉粥样硬化为代表的血管性疾病不仅是发达国家，还是发展中国家的首要致死性病变之一。外科手术置换病变血管是血管性疾病治疗的最终手段，因而需要各种血管置换材料。另外，随着食管癌发病率的逐年增高，人工食管置换材料的需求也越来越多。同种组织置换虽然是理想的置换材料，但来源少、存在伦理学限制。而当前随着生物科技的发展，现已研发出多种高分子生物合成材料作为人工组织置换材料。例如，PET(Polyethyleneterephthalate,Dacron)和ePTFE(Expandedpolytetra-fluoroethylene)、聚氨酯(Polyurethane)因其具有较好的生物力学性能和体内相容性而广泛应用于心血管外科手术。但是合成材料在临床应用时也有局限性，例如合成生物材料与天然组织不匹配是导致移植失败的重要因素，增加患者死亡率。另外，持续的慢性炎症反应所导致的移植组织内膜增生、慢性感染等风险增加了移植后期衰败的发生率。因此，研发一种在组织结构和功能上和正常主动脉、食管相类似的替代物至关重要。基于此原因，脱细胞猪主动脉因其在大体、显微镜下以及生理功能上类似于人主动脉而受到越来越多的关注。并且，有研究表明，猪主动脉在功能上可以代替食管。脱细胞是组织工程研究中降低移植组织免疫原性、保留移植物三维组织结构、生物力学性能、生物活性的重要方法，并且，脱细胞方法已成功应用于心脏瓣膜、前列腺、角膜、跟腱等组织工程研究中。现有技术一般使用去污剂来处理猪主动脉从而实现脱细胞的目的，虽然这种方法能取得良好的脱细胞效果，但是通过这种方法得到的脱细胞猪主动脉基质往往残存毒性，并且其生物力学性能也遭到了破坏。此外，大量研究表明脱细胞的猪主动脉的细胞外基质结构致密，因此，应用于宿主体内时细胞很难内生性生长，在宿主体内重塑效果不佳。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法。本专利技术提供了一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h；步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉水浴溶解；步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将猪主动脉进行多次冻融；步骤四，将多次冻融后的猪主动脉放置于低浓度去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h；步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h；以及步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉细胞的脱细胞基质，其中，低浓度去污剂缓冲液包括Tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠，Tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/L，PH值为7.4～7.8，十二烷基硫酸钠在Tris缓冲液的体积分数范围为0.1％～0.5％W/V，脱氧胆酸钠在Tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％W/V。在本专利技术提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤二中，水浴的温度为30～50℃。在本专利技术提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，Tris缓冲液的浓度为10mmol/L、PH为7.6。在本专利技术提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤一中，猪主动脉的冷冻时间为4～5h。在本专利技术提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤五中，去离子水的震荡清洗时间为24～36h。在本专利技术提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1～0.5mmol/L。在本专利技术提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤六中，磷酸盐溶液的震荡清洗时间为72h。专利技术的作用与效果根据本专利技术所涉及的猪主动脉脱细胞基质的制备方法，因为该制备方法中以猪主动脉为研究对象，采用低浓度去污剂作为缓冲液进行冷冻，然后水浴溶解，将猪主动脉经过多次冻融之后放置在去污剂缓冲液中震荡，最后分别用去离子水以及磷酸盐溶液对震荡后的猪主动脉进行震荡清洗，即可得到猪主动脉的脱细胞基质，所以，本专利技术的制备方法得到的脱细胞基质呈微孔样结构、力学性能优良，且无毒性，免疫原性低，钙化率低，可用于血管、食管等临床组织工程移植，且体内重塑性好。另外，由于本制备方法是以猪主动脉为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为组织工程血管、食管的临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例对本专利技术猪主动脉脱细胞基质的制备方法作具体阐述。猪主动脉脱细胞基质的制备方法主要包括以下步骤：步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h，低浓度去污剂缓冲液包括：Tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠。Tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/L，PH值为7.4～7.8，十二烷基硫酸钠在Tris缓冲液的体积分数范围为0.1％～0.5％W/V，脱氧胆酸钠在Tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％W/V。在本实施例中，缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠的配比为：Tris缓冲液的浓度为10mmol/L、PH为7.6，每100mL的Tris缓冲液中加入0.1～0.4g十二烷基硫酸钠和0.1～0.5g的脱氧胆酸钠。猪主动脉在低浓度去污剂缓冲液中的冷冻时间为4～5h。步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉放置在温度为30～50℃的水浴中溶解。步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将猪主动脉进行多次冻融。步骤四，将多次冻融后的猪主动脉从低浓度去污剂缓冲液中取出，然后放置于去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h。步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h。在本实施例中，无菌去离子水对猪主动脉的震荡清洗时间为24～36h，优选震荡时间为24h。步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉的脱细胞基质。在本实施例中，磷酸盐溶液对猪主动脉的震荡清洗时间为72h。以本实施例中的真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠(Vacuum-freeze-thawing-lowconcentrationSDS,VLS)处理得到的猪主动脉的脱细胞基质为实验组，以高浓度十二烷基硫酸钠(HighconcentrationSDS,HCS)处理得到的猪主动脉的脱细胞基质为对照组，对上述两组脱细胞基质进行结构以及性能测定，其得到的结果如下：(一)真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠方法能有效去除猪主动脉细胞DNA，形成连续的微孔样结构病理H&E染色表明，与正常猪主动脉相比，VLS方法和HCS均能有效去除细胞及细胞碎片。DNA定量检测结果为：HCS组的DNA含量为818.4±226.2ng/mg湿重组织；VLS组的DNA含量为497.5±323.6ng/mg湿重组织。DNA定量检测则表明，VLS和HCS均能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h；步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉水浴溶解；步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将所述猪主动脉进行多次冻融；步骤四，将多次冻融后的所述猪主动脉放置于低浓度去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h；步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h；以及步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉细胞的脱细胞基质，其中，所述低浓度去污剂缓冲液包括Tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠，所述Tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/L，PH值为7.4～7.8，所述十二烷基硫酸钠在所述Tris缓冲液的体积分数范围为0.1％～0.5％W/V，所述脱氧胆酸钠在所述Tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％W/V。

【技术特征摘要】
1.一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h；步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉水浴溶解；步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将所述猪主动脉进行多次冻融；步骤四，将多次冻融后的所述猪主动脉放置于低浓度去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h；步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h；以及步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉细胞的脱细胞基质，其中，所述低浓度去污剂缓冲液包括Tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠，所述Tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/L，PH值为7.4～7.8，所述十二烷基硫酸钠在所述Tris缓冲液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓红，夏翠萍，徐志云，龚德军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31