本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及miR‑497‑5p的抑制剂及其在制备肝纤维化治疗药物中的用途。本发明专利技术经过广泛而深入的研究，首次发现该抑制剂能与miR‑497‑5p序列互补结合，抑制miR‑497‑5p的功能进而促进Smad7的表达，该抑制剂可显著抑制肝星状细胞（产生I型、III型胶原纤维蛋白等细胞外基质的主要细胞）活化及I型胶原纤维的分泌，从而改善肝纤维化。亦即，本发明专利技术首次发现了miR‑497‑5p抑制剂在制备肝纤维化治疗药物中的新用途。
An inhibitor of microRNA-497-5p and its application in preparation of hepatic fibrosis drugs
The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to the inhibitor of microRNA 497 5p and its use in preparing medicines for treating liver fibrosis. After extensive and in-depth study, it is found for the first time that the inhibitor can complement and bind to the sequence of microRNA 497 5p, inhibit the function of microRNA 497 5p and promote the expression of Smad7. The inhibitor can significantly inhibit the activation of hepatic stellate cells (the main cells producing extracellular matrix such as type I and III collagen fibrin) and type I glue. Fibril secretion, thereby improving liver fibrosis. That is to say, for the first time, the present invention has found a new use of the inhibitor of microRNA 497 5p in the preparation of drugs for the treatment of liver fibrosis.
【技术实现步骤摘要】
一种miR-497-5p的抑制剂及其在制备肝纤维化药物中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及miR-497-5p的抑制剂在制备肝纤维化药物中的用途。
技术介绍
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码小RNA，长约22nt，存在于大多数真核细胞中，可以在转录后水平调控基因的表达。在细胞核中，首先RNA聚合酶II将编码miRNA的DNA片段转录成长度大约为300~1000bp的初始转录产物pri-miRNA，pri-miRNA经核酸酶Drosha加工后形成约70~90bp的miRNA前体(pre-miRNA)，pre-miRNA由核转运蛋白exportin5运出细胞核后，再由核酸酶Dicer加工为20~25bp的双链miRNA，双链中的一条与RNA沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）形成RISC-miRNA复合物后结合到靶基因mRNA的3’非编码区(3’UTR)，从而引导RISC降解靶基因mRNA或者阻遏靶基因mRNA的翻译。其特点有：（1）位于基因组非编码区；（2）进化上高度保守；（3）可在转录后水平对基因表达进行调节；（4）参与多种生命过程，调控多达30%蛋白的表达。成熟miRNA通过RNA诱导的沉默复合体（RISC）与靶信使核糖核酸（mRNA）特异性结合，从而抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。尤其微小RNA从5’端起第2-8位的核苷酸在相同微小RNA家族中高度保守，被称为种子序列（seedsequence），其在转录后水平抑制信使核糖核酸（mRNA）翻译过程中起至关重要作用。肝纤维化是机体对慢性肝损伤的代偿反应，其特征是细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）在肝脏内过度沉积，肝星状细胞（Hepaticstellatecell，HSCs）的活化是ECM的主要来源，是肝纤维化的中心环节。而引起肝纤维化的因素包括慢性乙型肝炎病毒感染、酗酒、非酒精性脂肪肝和寄生虫感染。华支睾吸虫（Clonorchissinensis）俗称肝吸虫，人和犬猫等哺乳动物因食入含有华支睾吸虫囊蚴的鱼虾而感染，其成虫主要寄生在人和哺乳动物的肝胆管内，其引起的华支睾吸虫病是一种严重的人畜共患寄生虫病，我国是华支睾吸虫病的高发区和主要流行区，广泛流行于我国26个省、市、自治区，人群普遍易感，是我国重点防治的食源性寄生虫病之一。华支睾吸虫排泄/分泌产物（excretory/secretoryproducts,ESPs）能导致人和动物肝脏与胆囊的组织损伤及功能改变，出现胆管炎、胆结石、肝纤维化、肝硬化等，甚至诱发胆管癌，其中最常见的病理改变是肝纤维化。TGF-β1能促进HSCs活化，使ECM的合成增加，降解减少，在肝纤维化的发生、发展中具有重要作用，其主要通过TGF-β/Smads信号转导通路发挥作用。Smad7是该通路中重要的负向调控因子，通过其MH2中的位点与Smad2竞争性结合活化的TGF-βⅠ型受体（TβR-Ⅰ），从而抑制Smad2发生磷酸化，并阻止Smad2与Smad4的结合和Smads复合物向核内转移。Smad7还可募集smurf2至活化的TGF-βrⅠ，使其泛素化和降解，从而抑制Smad2磷酸化，从而抑制活化的HSCs细胞中的TGF-β/Smad信号通路，从而减少胶原蛋白沉积和α-SMA的产生。目前，越来越多的研究表明miRNA可调控肝纤维化的发生、发展，如miR-29在调控HSCs细胞活化中具有重要作用，是一类抑制纤维化的miRNAs。HSCs细胞活化向MFB转化时，miR-29减少，而促纤维化基因如血小板衍生生长因子(PDGF)-B及胰岛素样生长因子(IGF)-I增多。TGF-β可以下调miR-29，通过活化HSCs及增加ECM沉积，从而加重纤维化程度。相反地，肝细胞生长因子(HGF)可以通过降低TGF-β水平，上调miR-29，从而抑制纤维化。另外，miR-29通过抑制PI3K/AKT信号通路减轻HSCs活化诱导其凋亡。在肝纤维化中，主miR-21表达上调；用PDGF-BB刺激人肝星状细胞（LX-2），COLⅠ及α-SMA均显著增多，miR-21也显著上调。通过转染miR-21抑制剂，LX-2细胞中miR-21表达下降，可以阻断PDGF-BB所诱导的LX-2细胞活化，因此miR-21在肝纤维化中起重要的调控作用。这些研究表明miRNA作为一种极其重要的基因表达调控因子和作用靶标，具有潜在的治疗作用和实际应用价值。虽然本领域中已知某些微小RNA与肝纤维化具有一定的相关性，但本领域已知的miRNAs种类繁多，功能各异，要从中筛选出与纤维化相关且可作为发病、治疗方案的选择及预后的miRNA存在较大难度。目前，本领域内尚无基于抑制miR-497功能进而对肝纤维化治疗、预后方面的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种miR-497-5p的抑制剂，该物质可促进Smad7的表达从而抑制HSCs的活化，用于治疗肝纤维化。本专利技术的目的是通过以下方式实现的：一种miR-407-5p的抑制剂用于调控Smad7蛋白表达，从而调控HSCs活化，进而调节肝纤维化的发生、发展。该抑制剂与miR-497-5p结合，抑制miR-497-5p表达及功能，抑制miR-497-5p与Smad73-UTR区结合，进而促进Smad7的转录与表达，调控HSCs活化；所述抑制剂为包含以下序列的核酸：具体序列为：5’-ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-’3。作为本专利技术所述的miR-497-5p的抑制剂的一种优化方案，所述抑制剂为miR-497-5p的互补序列。作为本专利技术所述的miR-497-5p的抑制剂的一种优化方案，所述抑制剂经过2ome，即：2-甲氧基，进行化学基团修饰，能够保持其稳定性。一种所述的miR-497-5p的抑制剂在制备肝纤维化药物中的应用。优选地，本专利技术提供了一种肝纤维化治疗药物制剂，含有序列为：5’-ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-’3的可接受的载体。所述抑制剂可通过化学合成而得。所述抑制剂也可来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。本专利技术抑制剂的获取来源可以是来自化学合成和存在该基因序列的细胞、组织，组织可以选自外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。在说明书中，术语“样本”指的是潜在可能含有微小miR-497-5p及其互补序列的离体循环血样本，优选地来源于人和小鼠的样本尽管用抽提出血总RNA的纯化样本也能够在本专利技术中使用，本专利技术的样本优选是未经提纯的、含有血总RNA的裂解液样本。本领域技术人员知晓将固体的有核细胞裂解或抽提、纯化并保持其中miRNA成分不被降解的细胞分子生物学技术。本专利技术的样本可以是经过处理的样本，如稀释处理、血细胞裂解处理以及PCR扩增等，也可是未经处理过的样本。经过处理过的样品可以进一步纯化，以富集miRNA。本文中，术语“miR-497-5p”指的是包含序列“5’-CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-’3”或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各来源的miR-497-5p，例如人、黑猩猩、马、鸡等，这些同本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种miR‑497‑5p的抑制剂，其特征在于：该抑制剂与miR‑497结合，抑制miR‑497表达及功能，抑制 miR‑497 与Smad7 3‑UTR区结合，进而促进Smad7的转录与表达，调控HSCs活化；所述抑制剂为包含以下序列的核酸：具体序列为：5’‑ACAAACCACAGUGUGCUGCUG‑’3。
【技术特征摘要】
1.一种miR-497-5p的抑制剂，其特征在于：该抑制剂与miR-497结合，抑制miR-497表达及功能，抑制miR-497与Smad73-UTR区结合，进而促进Smad7的转录与表达，调控HSCs活化；所述抑制剂为包含以下序列的核酸：具体序列为：5’-ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-’3。2.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑葵阳，颜超，汤仁仙，沈莉萍，于倩，李向阳，华慧，张波，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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