一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对、试剂盒及快速雌雄鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的有益效果是(1)避免了鸽翻肛、静脉采血或拔取羽毛，对鸽的应激大大下降；(2)可避免进行血液裂解或核苷酸的抽提，直接进行PCR；(3)引物设计在CHD保守区域，特异性高，PCR扩增效果好，扩增条带清晰，结果易判读。本发明专利技术还公开了一种试剂盒及快速雌雄鉴别方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对、试剂盒及快速雌雄鉴别方法
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对、试剂盒及雏鸽快速雌雄鉴别方法。
技术介绍
鸽的繁殖方式是典型的一夫一妻制，鸽的雌雄鉴别是鸽生产、繁殖工作中不可缺少的一环。如果雌雄比例不当，雄雄配对会出现鸽打斗、舍内不安定，雌雌配对则出现产蛋率下降、未受精蛋比例升高，均能影响种鸽生产成绩。由于鸽属于晚熟鸟类，在性成熟前较难区分性别，目前种场人员在种鸽140天龄后从鸽子的肛门、体型、行为及羽毛特征等方面进行鉴别，初步确定性别后进行配对，后期将根据配对鸽是否打斗、产蛋数量等评价配对结果，对于配对错误的鸽子，需后续进行校正。中国申请专利201010281972.4公开了一种可以鉴定禽类性别的PCR方法，该方法需拔取羽毛，将羽毛根部进行核酸抽提后进行PCR，根据PCR产物条带数量可以准确鉴别鸽、鹦鹉和鹌鹑的性别。中国申请专利201510799225.2公开了一种鉴定鸽子性别的PCR方法，该方法实用性较强，不需要对鸽血进行核酸抽提，直接用鸽血为模板进行PCR，根据PCR扩增结果即可判断鸽的性别。但是现有的常规鸽雌雄鉴别方法存在以下缺点：(1)错配率高，经验丰富的饲养员雌雄鸽配对准确率为80％，而对于新手准确率仅为50％，后期需要投入大量时间进行配对校正，严重影响种鸽的生产效率；(2)配种前期雌雄鸽混合饲养周期长，鸽只死淘率较高：鸽属于晚熟鸟类，前期雌雄鸽混合饲养时间较长，青年鸽舍常出现鸽只打斗，导致鸽群应激、舍内粉尘较大，青年鸽死淘比例较大；(3)高比例公鸽长期饲养，导致种场饲养成本较高：鸽在正常情况下，公：母＝6:4，因此有1/3多余公鸽会饲养至雌雄鉴别完成后才淘汰，多余公鸽提高了种鸽场饲养成本；而专利201010281972.4鸽、鹦鹉和鹌鹑雌雄鉴别方法需要拔取羽毛，将羽毛根部进行核酸抽提后(PPCR模板处理不同)才能进行PCR，导致样品前处理复杂，无法在鸽场大规模推广使用。而且专利201510799225.2的雌雄鉴别方法需要从鸽翅静脉采集血液，对鸽的应激较大，如果对创口处理不当，则易造成感染，同时该方法应用成本较高，导致种鸽场雌雄鉴别成本较大。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对，另一个目的是提供一种试剂盒。本专利技术的又一个目的是提供一种雏鸽快速雌雄鉴别的方法。根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。根据本专利技术的另一个方面，提供了上述用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对在制备鉴定鸽子性别的试剂盒中的用途。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种试剂盒，试剂盒中含有权利要求1的用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对。在一些实施方式中，试剂盒还包括Bio-readyTaqmix、EP管和高压灭菌ddH2O。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种雏鸽快速雌雄鉴别的方法，包括以下步骤：1)鸽血的采集：使用一次性指尖采血针在鸽鼻翼侧轻轻刺破，挤压后采集1μL血液至预装有去离子水的离心管中，混匀；2)PCR反应：在20μL反应体系中加入稀释的鸽血1μL进行PCR反应，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；3)结果判读：PCR反应结束后，根据条带数量和位置即可判定待测鸽子的性别。在一些实施方式中，结果判读的方法为：使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，雄鸽在601bp有单一条带，而雌鸽则在601bp和408bp处各有一条条带。PCR反应体系为：PCR反应条件为：PCR循环次数为40个。针对上述已有鉴定方法存在的缺点，本专利技术进行了有效改进，优点如下：(1)该鉴定方法使用指尖采血针采血，采血部位为鸽鼻翼，仅需采集1μL血量，避免了鸽翻肛、静脉采血或拔取羽毛，对鸽的应激大大下降，而且采血针经洗涤烘干后可重复使用；(2)该鉴定方法避免了鸽血的核酸抽提过程，直接使用稀释过的鸽血为模板进行PCR，使得操作过程大为简化，每个样品上样前处理时间由40min/只缩短为0.2min/只，大大提高了鉴定效率，有利于鸽管理员操作，方便大规模推广应用；(3)鸽血液中成分可以抑制绝大多数PCR酶的活力，所以经前期摸索，确定采集的鸽血需进行500倍稀释，实际操作时可以提前进行预分装；PCR时使用1μL稀释后的血液为模板，如此可避免进行血液裂解或核苷酸的抽提，直接进行PCR，由此避免了核酸抽提或者裂解的费用，同时使用BioreadyTaqmix酶，使得每只鸽的鉴别成本大为降低。(4)使用的引物设计在CHD保守区域，特异性高，PCR扩增效果好，扩增条带清晰，结果易判读，该鉴定方法灵敏度高，准确率达100％，有效避免了常规雌雄鉴别的错配率。(5)该鉴定方法将鸽雌雄鉴别时间提早至1日龄，有力的促进了鸽育种与配对工作的前置化，有利于雌雄雏鸽分开保健与选育、提早淘汰未配对鸽，降低鸽的饲养成本，大大推动了养鸽业的发展。附图说明图1为本专利技术实施例中鸽子血液PCR产物凝胶电泳电泳后的图谱。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步详细的说明。下面参考具体实施例，对本专利技术进行说明，需要说明的是，若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例(1)引物设计收集NCBI数据库中公布的所有鸽类CHD序列并进行对比，针对较为保守区域设计一对原创的引物对，包括上游引物CHD-ZWF和下游引物CHD-ZWR。其中，上游引物CHD-ZWF的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物CHD-ZWR的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。上游引物CHD-ZWF：SEQIDNO:1ATCCAGTGCTTGTTTCCTYARTTCC下游引物CHD-ZWR：SEQIDNO:2CAGCGTACTSATTTTCTCWCAGATGG经检索比对确定该引物与已有报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于雏鸽雌雄鉴别。(2)鸽血的采集：使用一次性指尖采血针在鸽鼻翼侧轻轻刺破，挤压后采集1μL血液至预装有去离子水的离心管中，混匀。(3)PCR反应：在20μL反应体系中加入稀释的鸽血1μL、上下游引物各1uL。PCR反应体系如下表1。表1PCR反应体系组成配方表组分用量2×LaTaqmix10μL血样1μL上游引物CHD-ZWF1μL下游引物CHD-ZWR1μLddH2O7μL其中，其中LaTaqmix购于博日公司，ddH2O为高压的去离子水，上下游引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，工作浓度为10μM。PCR条件如下表2。表2PCR条件表(4)结果判读：PCR反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳电泳进行检测，雄鸽在601bp有单一条带，而雌鸽则在601bp和408bp处各有一条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对在制备鉴定鸽子性别的试剂盒中的用途。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的用于雏鸽快速雌雄鉴别的引物对。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Bio-readyTaqmix、EP管和高压灭菌ddH2O。5.一种雏鸽快速雌雄鉴别的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)鸽血的采集：使用一次性指尖采血针在鸽鼻翼侧轻轻刺破，挤压后采集1μL血液至预装有去...

【专利技术属性】
技术研发人员：王占新，李健，刘金，刘佳佳，鲁俊鹏，覃健萍，
申请(专利权)人：温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44