一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。本发明专利技术提供的AlphaLISA检测试剂盒包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。本发明专利技术还提供了一种B型金葡菌肠毒素的检测方法，本发明专利技术提供的B型金葡菌肠毒素的检测方法是采用AlphaLISA技术检测B型金葡菌肠毒素。通过实验证明：本发明专利技术的B型金葡菌肠毒素的检测方法可以大大降低蛋白A的影响，且本发明专利技术的检测方法快速、准确、可靠，具有良好的应用前景。

A Kit for AlphaLISA Detection of Staphylococcus aureus Enterotoxin B

The invention discloses an AlphaLISA detection kit for type B Staphylococcus aureus enterotoxin. The AlphaLISA detection kit provided by the invention includes SEB capture antibody labeled receptor microspheres, biotin labeled SEB detection antibodies and streptavidin labeled donor microspheres. The invention also provides a detection method for type B Staphylococcus aureus enterotoxin, and the detection method for type B Staphylococcus aureus enterotoxin is to use AlphaLISA technology to detect type B Staphylococcus aureus enterotoxin. Experiments show that the detection method of type B Staphylococcus aureus enterotoxin of the invention can greatly reduce the influence of protein A, and the detection method of the invention is fast, accurate and reliable, and has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。
技术介绍
SEB(B型金葡菌肠毒素)是金葡菌分泌到上清中的重要毒素，它是重要的生物战剂，同时也是金葡菌污染导致食物中毒的重要因素。SEB本身没有细胞毒性，其毒性来源于其超抗原特性。所谓超抗原(Superantigen，SAg)是一类不需要抗原提呈细胞(antigen-presentingcell，APC)处理而能够直接与MHCⅡ类分子结合，导致带有特异Vβ节段T细胞大量增殖的抗原分子。其激活能力是普通抗原的2000-50000倍，因此只需极低浓度(1～10pg/mL)即可刺激T细胞活化增殖，释放大量细胞因子。SEB对人中毒剂量低，在气溶胶吸入的情况下，ED50(50％effectivedose，半数有效量)为1ng/kg，LD50(50％lethaldose，半数致死量)为0.02μg/kg。对于SEB引起的中毒，需要直接对毒素进行鉴定；如为食品污染，则首先应对可疑食品进行细菌培养，如发现葡萄球菌生长，再进行产毒试验。如果能在可疑食品中既培养出细菌，又检测出毒素，即能明确诊断。但是在对金葡菌培养上清中的毒素进行免疫学鉴定时，金葡菌的培养上清中同时存在蛋白A，该蛋白能够与多种哺乳动物IgG抗体的Fc段结合，导致免疫学结果出现假阳性。目前解决该问题的方法是对抗体进行改造，去除其Fc段，但是制备Fab段相对复杂；或者用羊抗体，但是制备羊抗体相对鼠单抗较为麻烦。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何降低蛋白A对B型金葡菌肠毒素检测的影响。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。本专利技术提供的AlphaLISA检测试剂盒包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。上述试剂盒中，所述SEB捕获抗体标记的受体微球为SEB捕获抗体标记的受体微球溶液。所述SEB捕获抗体标记的受体微球溶液的工作浓度为10-20μg/mL；优选为13.3μg/mL。所述生物素标记的SEB检测抗体为生物素标记的SEB检测抗体溶液。所述生物素标记的SEB检测抗体溶液的工作浓度为0.2-0.8μg/mL；优选为0.4μg/mL。上述试剂盒还包括AlphaLISA反应缓冲液。所述AlphaLISA反应缓冲液具体为10×AlphaLISA反应缓冲液，其配方如下：250mMHEPES(pH7.4)，1％Casein，10mg/mLDextran-500，5％TritonX-100和0.5％Proclin-300。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了上述试剂盒的新用途。本专利技术提供了上述试剂盒在检测B型金葡菌肠毒素中的应用。本专利技术还提供了上述试剂盒在制备检测B型金葡菌肠毒素的产品中的应用。本专利技术还提供了上述试剂盒在检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素中的应用。本专利技术还提供了上述试剂盒在制备检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的产品中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术最后提供了一种检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法。本专利技术提供的检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法包括采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的步骤。上述方法中，采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法包括如下步骤：(1)将SEB捕获抗体标记受体微球，得到SEB捕获抗体标记的受体微球；(2)将生物素标记SEB检测抗体，得到生物素标记的SEB检测抗体；(3)将所述SEB捕获抗体标记的受体微球和所述生物素标记的SEB检测抗体加入各检测孔中，然后向所述检测孔中加入待测样品，孵育；(4)向(3)得到的检测孔中加入链霉亲和素标记的供体微球，孵育；(5)读取所述检测孔的检测信号值，根据所述检测信号值判断待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素。上述方法中，所述(1)还包括如下步骤：用AlphaLISA反应缓冲液将所述SEB捕获抗体标记的受体微球按照1:150的比例进行稀释，得到受体微球溶液；所述(2)还包括如下步骤：用AlphaLISA反应缓冲液将所述生物素标记的SEB检测抗体按照1:1000的比例进行稀释，得到生物素化抗体溶液。上述方法中，所述(3)还包括如下步骤：将所述受体微球溶液和所述生物素化抗体溶液混匀，得到混合液；将所述混合液加入所述检测孔中。在本专利技术中，所述SEB捕获抗体标记的受体微球在混合液中的浓度为33.33μg/mL，所述生物素标记的SEB检测抗体在混合液中的浓度为1μg/mL。上述方法中，所述(3)中，所述孵育的条件为37℃孵育15分钟；所述(4)中，所述孵育的条件为37℃孵育10分钟。上述方法中，所述(5)中，采用SpectramaxI3的AlphaLISA模块读取所述检测孔的检测信号值，若待测样品的检测信号值大于本底值+3SD，则所述待测样品含有或候选含有B型金葡菌肠毒素，否则待测样品中不含有或候选不含有B型金葡菌肠毒素。上述方法中，所述本底值具体为本底平均值，所述本底平均值为步骤(3)中不加待测样品，且保持其余步骤不变得到的检测信号值的平均值。上述试剂盒或方法中，所述SEB检测抗体和SEB捕获抗体均可按照现有技术中的常规方法制备得到，也可以购买获得。具体制备方法可参照文献“雷祚荣，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，中国科学技术出版社”中的“肠毒素单克隆抗体制备”记载的方法。本专利技术提供了一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。该试剂盒包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。本专利技术还提供了一种B型金葡菌肠毒素的检测方法，本专利技术提供的B型金葡菌肠毒素的检测方法是采用AlphaLISA技术检测B型金葡菌肠毒素。通过实验证明：本专利技术的B型金葡菌肠毒素的检测方法可以大大降低蛋白A的影响，且本专利技术的检测方法快速、准确、可靠，具有良好的应用前景。附图说明图1为蛋白A对AlphaLISA和ELISA检测SEB的影响。A为AlphaLISA和ELISA检测梯度稀释的蛋白A。蛋白A从100μg/mL到0.01μg/mL进行10倍梯度稀释，X轴是蛋白A浓度的对数。Y轴是AlphaLISA和ELISA检测的信号值。B为蛋白A对AlphaLISA和ELISA检测SEB的影响。X轴是SEB的浓度，Y轴是信号比值，其具体计算公式为VSEB+PA/VSEB。VSEB+PA为SEB和蛋白A混合物的检测信号值，VSEB为SEB溶液的检测信号值。图2为AlphaLISA和ELISA检测菌株上清中的SEB。A为R-BiopharmRIDASCREEN检测上清中的SEB。B为RT-qPCR检测seb基因的表达。1-10为9个分离株和1个阴性对照。9个分离株分别是1169、3-4、AT、SC2、2-1、3-3、SC1、A8和SC3。C为ELISA和AlphaLISA检测金葡菌上清中的SEB。结果以Vtest/Vcutoff表示。Vtest为上清的检测值，Vcutoff为cutoff值，cutoff值为本底平均值+3SD。图3为AlphaLISA检测SEB的灵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒，其包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。

【技术特征摘要】
1.一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒，其包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述SEB捕获抗体标记的受体微球为SEB捕获抗体标记的受体微球溶液，所述SEB捕获抗体标记的受体微球溶液的工作浓度为10-20μg/mL；或，所述生物素标记的SEB检测抗体为生物素标记的SEB检测抗体溶液，所述生物素标记的SEB检测抗体溶液的工作浓度为0.2-0.8μg/mL。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述SEB捕获抗体标记的受体微球溶液的工作浓度为13.3μg/mL；或，所述生物素标记的SEB检测抗体溶液的工作浓度为0.4μg/mL；或，所述试剂盒还包括AlphaLISA反应缓冲液。4.权利要求1-3任一所述的试剂盒在检测B型金葡菌肠毒素中的应用；或，权利要求1-3任一所述的试剂盒在制备检测B型金葡菌肠毒素的产品中的应用；或，权利要求1-3任一所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素中的应用；或，权利要求1-3任一所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的产品中的应用。5.一种检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法，包括采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法包括如下步骤：(1)将SEB捕获抗体标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：律清宇，江华，姜永强，刘鹏，郑玉玲，孔德聪，赵俊清，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11