一种用于评估HPV16疫苗免疫效果的阻断ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合HPV16 E6蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明专利技术还公开了应用本发明专利技术的单克隆抗体评估HPV16亚型疫苗免疫效果的试剂盒及其制备方法，该试剂盒采用阻断ELISA原理制备，有利于提高准确率，减少假阳性，为评估临床HPV16亚型疫苗免疫效果提供指导。

A Blocking ELISA Kit for Evaluating the Immunity Effect of HPV16 Vaccine

The invention discloses a monoclonal antibody specifically binding to HPV16 E6 protein and its application. The invention also discloses a kit for evaluating the immune effect of HPV16 subtype vaccine by applying the monoclonal antibody of the invention and its preparation method. The kit is prepared by blocking ELISA principle, which is beneficial to improving the accuracy and reducing false positive, and provides guidance for evaluating the clinical immune effect of HPV16 subtype vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种用于评估HPV16疫苗免疫效果的阻断ELISA试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种检测HPV疫苗接种者体内HPV16免疫抗体含量的ELISA试剂盒，为疫苗免疫情况做指导。
技术介绍
人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种属于乳多空病毒科(Papovaviridae)的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。表现为寻常疣、生殖器疣(尖锐湿疣)等症状。随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门癌等的增多，HPV感染越来越引起人们的关注。但并不是所有的HPV基因型均诱发癌症，根据其亚型不同，可分为低危型和高危型两种。低危型HPV主要引起寻常疣、趾疣、扁平疣等，而高危型的HPV感染主要造成生殖器疣和宫颈癌。目前了解最深入的HPV致癌的范例是女性宫颈癌，2008年HaraldzurHausen因证明了HPV病毒是导致宫颈癌的病原体而获得了诺贝尔生理医学奖。子宫颈癌是第二位常见女性恶性肿瘤，全球每年大约有50万女性被诊断为宫颈癌，其中超过半数的女性因此而死亡。几乎所有的宫颈癌的发生都是高危型HPV持续感染导致的，高危型HPV16型和18型与70％宫颈癌发病有关。令人欣慰的是，2006和2007年首先已由美国默克(Merck)和英国葛兰素史克(GSK)制药公司研制成功二种预防性四价和二价HPV疫苗，美国默沙东公司研制的九价预防性HPV也已于2018年4月28日在中国上市。这些疫苗均包含来源于HPV早期蛋白(如，E6、E7)的抗原决定簇，这是因为E6和E7在HPV感染极大多数宫颈癌及癌前期病变中均持续表达，而在正常组织中不表达。同时，E6、E7的持续表达对诱导和维持癌细胞的恶性表型是必需的，癌细胞在抗原丢失中不太可能逃过免疫反应，动物实验结果表明，以乳头瘤病毒的早期蛋白为靶抗原的疫苗既能产生预防作用又能产生治疗作用。因此，E6、E7蛋白就成为抗原特异性治疗HPV慢性感染以及相关病变如宫颈癌疫苗的理想靶点，但是最近研究发现HPV早期蛋白E6诱发的免疫反应比E7蛋白更常见，而且具有更强的免疫原性。目前HPV疫苗接连审批上市，实际应用中缺乏用于评估疫苗免疫效力的简便易行灵敏准确的血清学检测方法，即是以重组蛋白ELISA包被抗原，以高灵敏的抗HPV16单克隆抗体为竞争抗体建立阻断ELISA检测方法，从而鉴定HPV疫苗接种者血清中存在的抗体。至今未见血清学检测方法或Kit在临床检验中的实际应用。故本领域急需亲和力高、特异性强的抗HPV抗体及其试剂盒来通过检测疫苗免疫后个体血清中存在的抗体的量确定疫苗效价。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种针对HPV16E6蛋白的单克隆抗体及应用其制备的用于检测HPV16中和抗体含量的ELISA试剂盒。本专利技术的第一方面提供了一种特异性结合HPV16E6蛋白的单克隆抗体，它由小鼠杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2018153分泌。本专利技术的第二方面提供了一种分泌本专利技术的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2018153。本专利技术的第三方面提供了本专利技术的单克隆抗体在制备用于评估HPV16疫苗免疫效果的阻断ELISA试剂盒中的应用。本专利技术的第四方面提供了一种用于评估HPV16疫苗免疫效果的阻断ELISA试剂盒，其中，所述试剂盒包含本专利技术的单克隆抗体，所述单克隆抗体用于检测HPV16疫苗接种者血液中抗HPV16免疫抗体的含量。在本专利技术的一个优选实施方案中，在所述试剂盒中，用于结合所述单克隆抗体和HPV16疫苗接种者血液中抗HPV16免疫抗体的抗原是由SEQIDNO：2所示的核酸序列编码的HPV16E6重组蛋白，其包被浓度为lug/ml，所述单克隆抗体是用HRP标记的单克隆抗体，并且在使用时以1∶4000稀释比例进行稀释。在本专利技术的一个优选实施方案中，在用所述试剂盒检测时，被检样本的阻断率大于或等于40％，所述样本就可以被判为阳性，即，有HPV16抗体存在，免疫效果良好；如果被检样本的阻断率小于或等于30％，所述样本就可以被判为阴性，即无抗HPV16抗体存在，建议重新接种疫苗；如果被检样本的阻断率在30～40％之间，则判定为疑似，需要再次检测。本专利技术的第五方面提供了一种制备本专利技术的阻断ELISA试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备HPV16E6重组蛋白，其由SEQIDNO：2所示的核酸序列编码；(2)以步骤(1)获得的重组蛋白作为免疫原，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体；(3)将步骤(1)获得的重组蛋白包被酶标板；(4)用HRP标记步骤(2)获得的单克隆抗体；从而制备以阻断ELISA为原理检测疫苗免疫者血清中HPV16免疫抗体的阻断ELISA试剂盒。在本专利技术的一个优选实施方案中，在步骤(1)中，在扩增E6蛋白基因时，对密码子进行优化，以利于得到免疫原。在本专利技术的一个优选实施方案中，在步骤(3)中，重组蛋白的包被浓度为1ug/ml。在本专利技术的一个优选实施方案中，用HRP标记的单克隆抗体在使用时以1∶4000稀释比例进行稀释。本专利技术的有益效果是：HPV16E6单克隆抗体对HPV16亚型具有中和作用，通过间接阻断ELISA检测HPV16亚型疫苗接种者体内中和抗体的含量情况，为疫苗接种、临床用药、治疗等提供指导依据。附图说明通过参照以下附图结合对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更加明显：图1为显示通过PCR扩增的HPV16E6基因序列的凝胶电泳图。图2为将HPV16E6基因与表达载体PET30a连接，通过PCR验证，最终得到的正确的转化子的测序的凝胶电泳图。图3为通过SDS-PAGE检测HPV16E6蛋白质表达情况的SDS-PAGE图。图4为显示HPV16E6蛋白纯化结果SDS-PAGE图。图5为通过WB(蛋白质印迹)方式检测组织中HPV16E6蛋白表达情况的图。图6为通过间接阻断ELISA检测本专利技术的抗体抑制HPV16阳性血清结合抗原的能力的曲线图。具体实施方式下面将结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。以下实施方式将有助于本领域技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。实施例实验所用试剂和仪器：HAT培养基(购自Sigma公司)、HT培养基(购自Sigma公司)、RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)、羊抗鼠IgG-HRP抗体(购自Sigma公司)、胎牛血清(购自GIBCO公司)、DMSO(购自Sigma公司)、50％PEG(购自Sigma公司，分子量1450)、DMEM培养基(购自GIBCO公司)、TMB(Sigma公司)。实施例1抗HPV16E6抗原的单克隆抗体的制备1.HPV16E6基因克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成HPV16E6蛋白序列，为确保蛋白成功表达，合成的同时进行密码子优化。1.1HPV16E6基因序列的合成委托生工合成HPV16E6蛋白序列，为确保蛋白成功表达，合成的同时进行密码子优化。原DNA序列：优化合成的DNA序列：PCR扩增所用引物序列如下：上游引物：5’-TTTGAATTCATGCATCAGAAACGTACCGC-3’(SEQIDNO：3)下游引物：5’-TTTCTCGAGCAGCTGGGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合HPV16 E6蛋白的单克隆抗体，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2018153分泌。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合HPV16E6蛋白的单克隆抗体，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2018153分泌。2.一种分泌根据权利要求1所述的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系CCTCCNO：C2018153。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于评估HPV16疫苗免疫效果的阻断ELISA试剂盒中的应用。4.一种用于评估HPV16疫苗免疫效果的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体用于检测HPV16疫苗接种者血液中抗HPV16免疫抗体的含量。5.根据权利要求4所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒中，用于结合所述单克隆抗体和HPV16疫苗接种者血液中抗HPV16免疫抗体的抗原是由SEQIDNO：2所示的核酸序列编码的HPV16E6重组蛋白，其包被浓度为1ug/ml，所述单克隆抗体是用HRP标记的单克隆抗体，并且在使用时以1∶4000稀释比例进行稀释。6.根据权利要求4或5所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，在用所述试剂盒检测时，被检样本的阻断率大于或等于40％，所述样本就可...

【专利技术属性】
技术研发人员：王朋，马玉岭，白晓磊，刘希宇，
申请(专利权)人：北京索莱宝科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11