甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种非生物胁迫特异性表达的启动子，尤其涉及甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用，属于植物基因工程领域。本发明专利技术提供一种甘薯IbCBF3非生物胁迫特异性表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术的DNA片段是甘薯低温胁迫途径中关键转录因子IbCBF3的启动子，该启动子含有多个逆境和激素响应元件。通过在烟草叶片中双荧光酶系统分析，该启动子在低温胁迫下与上游基因IbICE1快速结合，诱导下游基因的表达情况，可以用于甘薯耐低温性研究和转基因育种。

Promoter of IbCBF3 Gene Specific Expression under abiotic Stress in Sweet Potato and Its Application

The invention relates to a promoter for abiotic stress specific expression, in particular to a promoter for abiotic stress specific expression of IbCBF3 gene in sweet potato and its application, belonging to the field of plant genetic engineering. The invention provides a promoter specifically expressing abiotic stress of sweet potato IbCBF3, the nucleotide sequence of the promoter is shown in SEQ ID NO.1, and the DNA fragment of the invention is a promoter of IbCBF3, a key transcription factor in the low temperature stress pathway of sweet potato, which contains multiple stress and hormone response elements. Through the analysis of double fluorescent enzyme system in tobacco leaves, the promoter rapidly binds to the upstream gene IbICE1 under low temperature stress to induce the expression of downstream genes, which can be used for the study of low temperature tolerance and transgenic breeding of sweet potato.

【技术实现步骤摘要】
甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用
本专利技术涉及一种非生物胁迫特异性表达的启动子，尤其涉及甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用，属于植物基因工程领域。
技术介绍
温度是植物生长发育过程中最重要的环境因素之一。低温不仅影响农作物生长发育和产量，也制约农作物的耕作时间和地理分布。据联合国粮食及农业组织(FAO，FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations)最新数据统计，我国甘薯种植面积为337万公顷，占世界种植面积的40％，是最大的种植甘薯国；总产量713万吨，占世界甘薯产量的73％。甘薯因其耐贫瘠、易管理、产量高和丰富的营养价值，广泛的应用在人们日常消费、动物饲料以及工业燃料中，是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食产物。然而甘薯喜温、不耐寒，与水稻、玉米、棉花相似，易受低温影响，造成减产。甘薯不论苗期生长或是收获后储藏对低温都非常敏感。当气温降到15℃，甘薯就停止生长，低于9℃，薯块将逐渐受冷害而腐烂；地上部茎叶经霜冻后很快丧失活力而死亡。甘薯的不耐低温性严重制约了甘薯产业的发展。为应对低温等各种非生物逆境，植物形成了复杂的调控网络来感知、响应及适应外界环境的变化。ICE-CBF转录因子途径在植物抗寒机理研究的最为深入。在许多植物中，过表达ICE或CBF都可以提高植物的抗寒性。在拟南芥中，CBF3转录因子不仅调控大量下游抗逆基因的表达，同时其自身的表达也受到上游基因的作用。其上游转录因子ICE1可以结合在CBF3启动子的MYC元件(或ICEbox)上来激活CBF3的表达以应答低温胁迫。在本专利技术中我们根据甘薯主栽品种徐薯18中克隆得到的IbCBF3基因序列，设计引物通过染色体步移的方法获得该基因的启动子序列。用PLACE中的plantcare软件对该序列进行了分析，启动子元件预测结果显示：在IbCBF3启动子中除了转录必须的TATA-box、GATA-box以CAAT-box等保守元件外，还存在一些感应环境胁迫、光、水分、激素应答及生长发育调节的元件，如响应参与光调节的ACE、ATCT-motif、GATT-motif、G-box和I-box等；脱落酸应答因子ABRE；乙烯应答因子ERE和茉莉酸甲酯应答因子CGTCA-motif等。此外该启动子还包含多个能与上游调控因子ICE基因结合MYCRE顺式作用元件CANNTG等。并利用双荧光表达系统，通过烟草叶片的瞬时表达，验证该启动子在低温条件下可以结合到上游基因，诱导和低温胁迫有关基因的表达。
技术实现思路
本专利技术旨在提供甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用，该启动子属于低温响应途径中关键转录因子CBF3的启动子，内容涉及其cDNA全长序列、功能域分析，该基因低温胁迫诱导下能与上游基因IbICE1结合，诱导下游基因的表达。本专利技术的第一个目的是提供一种甘薯IbCBF3非生物胁迫特异性表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。扩增所述甘薯IbCBF3启动子任意片段的引物对如SEQIDNO.2～11所示。扩增所述甘薯IbCBF3启动子全长的引物对如SEQIDNO.12～13所示。甘薯IbCBF3上游基因IbICE1，其特征在于序列表中SEQIDNO.14所示的cDNA片段。扩增所述甘薯IbICE1启动子全长的引物对如SEQIDNO.15～16所示。本专利技术实施例中提供构建甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子的方法，(1)对甘薯IbCBF3基因启动子的克隆，以甘薯cDNA为模板，对该序列PCR扩增，获得甘薯IbCBF3基因启动子序列全长；(2)构建甘薯IbCBF3上游基因IbICE1，连接到T-blunt载体上，并将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得重组载体IbCBF3pro-GUS和CaMV35S-IbICE1；(3)重组载体质粒分别转化至农杆菌菌株GV3101中，在YEP培养基中提取单菌落基因组进行PCR验证。本专利技术的第二目的是提供含有所述启动子的重组载体。所述本专利技术的一种实施例中，所述重组载体为IbCBF3pro-GUS和CaMV35S-IbICE1。本专利技术还提供一种烟草双荧光酶表达系统的构建，含有重组载体、重组菌、转基因细胞系或表表达盒。所述含有上述SEQIDNO.1和SEQIDNO.14所示的DNA片段。本专利技术的第三目的是利用上述甘薯低温诱导特异性表达的启动子在植物的遗传育种中的应用。所述启动子为核苷酸序列中的2118位碱基的核酸序列,该核酸序列编码一个受低温诱导的、能调控冷诱导基因的转录因子。所述启动子区域包含4个ABRE、1个ERE和1个CGTCA-motif等顺式作用元件,能特异的对脱落酸、乙烯和茉莉酸甲酯等激素应答。该启动子还包含5个MYCRE顺式作用元件CANNTG,能与上游调控因子IbICE1基因结合。利用该基因启动子和上游调控基因IbICE1构建双荧光素酶报告系统载体，并利用农杆菌介导技术注射烟草叶片。实验表明在烟草受到低温胁迫时，IbICE1能与该基因启动子强烈结合，诱导报告基因(GUS基因)的表达。本专利技术的有益效果：本专利技术的DNA片段是甘薯低温胁迫途径中关键转录因子IbCBF3的启动子，该启动子含有多个逆境和激素响应元件。通过在烟草叶片中双荧光酶系统分析，该启动子在低温胁迫下与上游基因IbICE1快速结合，诱导下游基因的表达情况，可以用于甘薯耐低温性研究和转基因育种。附图说明图1为双荧光表达载体示意图图2为烟草叶片中启动子受低温诱导结合上游基因具体实施方式实施例1甘薯IbCBF3基因启动子的克隆根据甘薯低温胁迫信号传导途径中重要的转录因子IbCBF3的cDNA序列，按Clontech公司的genomewalker试剂盒说明书要求利用已获得的IbCBF3基因的全长序列设计3个特异性引物(SEQIDNO.2:SP1:5'-GAAGTTGAGACAGGCGGAGCAG-3’；SEQIDNO.3SP2:5'-GTCTCCCGAAACTTCTTCCTCCC-3'；SEQIDNO.4SP3:5’-CCAACAACACCTCTTCATCCGACA-3',设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置位于SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧)和试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4为引物进行巢式PCR扩增。将扩增结果进行胶回收后测序。设计SEQIDNO.5～6(SEQIDNO.5:5’-TGATAGTGAGTTGGGTTAGC-3；SEQIDNO.6:5’-TCCATATACGGCGGTACTT-3’),以甘薯cDNA为模板，对该序列PCR扩增，扩增产物进行胶回收后测序，验证该序列。并根据测序结果，设计第二次genomewalking的特异引物(SEQIDNO.7SP4:5’-GGAGTGTGATAAGGAGACAG-3’；SEQIDNO.8SP5:5’-CGCTACTGAAAGAGACAACA-3’；SEQIDNO.9SP6:5’-CCTTCACGGTGCAGAATG-3’,SP6的位置位于SP5的内侧，SP5位于SP4的内侧)和试剂盒中提供的四种经过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子；其特征在于：扩增所述甘薯IbCBF3启动子任意片段的引物对如SEQIDNO.2～11所示。3.根据权利要求2所述的甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子；其特征在于：扩增所述甘薯IbCBF3启动子全长的引物对如SEQIDNO.12～13所示。4.根据权利要求3所述的甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子；其特征在于：构建甘薯IbCBF3上游基因IbICE1，其特征在于序列表中SEQIDNO.14所示的cDNA片段。5.根据权利要求4所述的甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子；其特征在于：扩增所述甘薯IbIDE1启动子全长的引物对如SEQIDNO.15～16所示。6.根据权利要求5所述的甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子；其特征在于：构建甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子的方法，(1)对甘薯IbCBF3基因启动子的克隆，以甘薯cDNA为模板，对该序列PCR扩增，获得甘薯IbCBF...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳容，刘明，李洪民，张爱君，陈晓光，唐忠厚，
申请(专利权)人：江苏徐淮地区徐州农业科学研究所江苏徐州甘薯研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32