三维蜜胺海绵络合Fe制造技术

本发明专利技术涉及一种三维蜜胺海绵络合Fe

Three-dimensional melamine sponge complex Fe

The invention relates to a three-dimensional melamine sponge complex Fe.

【技术实现步骤摘要】
三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法
本专利技术涉及一种固定酶的新型整体材料，属功能材料制备

技术介绍
对于现代工业来说，游离酶不是一种理想的催化剂。游离酶存活的温度、pH值范围都比较窄，酶容易变性和失活。对热、酸、碱、有机溶剂均不稳定在催化反应方面有难以克服的缺点：（1）容易发生微生物降解或聚集而失活；（2）在均相催化体系中，酶难以与产物分离，导致产物不纯，影响产物质量；（3）不能实现连续操作。（4）游离酶不易回收，难以重复使用，成本昂贵。为了克服游离酶的缺点，人们探索将水溶性酶进行固定，使之保留酶的催化活性，提高它的稳定性。固定后的酶容易分离固液分离，实现酶的重复使用。蜜胺海绵是一种具有三维网状结构的环保型市售海绵材料，该海绵具有优良的稳定性、吸声性、隔热性、弹性以及无毒性，所以通常这种海绵被用作管道系统的绝缘隔音隔热和用于厨房的清洁物件。根据海绵具有的特性，本专利技术应用蜜胺海绵上固有的伯胺与Fe3+络合来固定酶。
技术实现思路
鉴于蜜胺海绵具有的特性，本专利技术的目的在于提供一种三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法，利用蜜胺海绵上固有的伯胺与Fe3+络合固定酶。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现：一种三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法，其步骤是：a材料（MS@Fe3+）的制备市场购买的蜜胺海绵不经过任何处理，直接用打孔器打出孔径为d=1.2cm，厚度h=1cm的圆柱状，保证海绵的的质量为10mg，将称好的海绵放到的FeCl3溶液中浸泡10min后，用镊子取出来挤压数次，用滤纸将海绵中的水吸干，在60℃真空干燥箱里干燥12h，就得到了络合了Fe3+的材料（MS@Fe3+）；a.酶的固定纯化酶，称取漆酶溶于水中，在4℃下，在转速为12000rpm冷冻离心机离心15min，取上清液冻干，放在4℃备用；称取纯化的漆酶溶于20ml、pH=2-9,50mM、50mM的磷酸的缓冲液中，取缓冲液20ml，加入步骤a得到了络合材料（MS@Fe3+），并在摇床中25℃下过夜，酶的上载量通过Beford法检测为每毫克固体颗粒能够固定180微克的漆酶，镊子挤压回收该固定化酶，并用pH=4，50mM磷酸的缓冲液洗涤材料数次,以除去材料上物理吸附的酶和溶液中未固定的游离酶。上述的固定酶的方法同样适用于脂肪酶和胰蛋白酶。本专利技术的优点和产生的有益效果：本专利技术将廉价易得、稳定性良好的环保型蜜胺海绵作为新型酶载体用于漆酶的固定，本方法对海绵的修饰不采用传统的涂覆、接枝或原位生长，而是直接利用海绵上现有的伯胺与Fe3+的络合作用，不需要过多修饰，从而固定漆酶，本方法具有的优点是：（1）非常简便快速，只需浸泡10min就能完成对海绵的修饰；（2）绿色环保，不需要有机溶剂的参与；（3）静电作用对酶的构象影响小；（4）最大程度地保留海绵的框架和弹性使得海绵作为整体材料，具有完整的三维结构和高弹性，回收简便。该材料同样适用于胰蛋白酶和脂肪酶的固定，说明该材料对酶的固定具有普适性。这种三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定形成的3D酶反应器相当于无数层膜的组合，像膜一样用于样品前处理、废水处理、有机催化等领域。附图说明图1为本专利技术所合成的MS@Fe3+材料并用于漆酶固定的示意图。图2为本专利技术中MS、MS@Fe3+、MS@Fe3+@Laccase的红外谱图。图3为本专利技术中，（a）为MS、MS@Fe3+、MS@Fe3+@Laccase的XPS全谱；（b）为MS、MS@Fe3+、MS@Fe3+@Laccase的XPS的Fe的精细谱。图4为本专利技术中游离酶和固定化酶的动力学曲线和动力学常数。图5为本专利技术中游离酶和该固定化酶在不同pH相对酶活。图6为本专利技术中游离酶和该固定化酶在60℃下孵化不同时间的相对酶活。图7为本专利技术中游离酶和该固定化酶在室温下放置不同时间的相对酶活。图8为本专利技术中固定化酶的重复使用性。图9为刚果红（a）和孔雀石绿（b）降解前后的紫外对比图。图10为10mg的固定化漆酶对不同体积的0.5mM的的降解率。具体实施方式下面结合附图和实施例及实验例对本专利技术技术方案再做进一步说明：实施例1市场购买的蜜胺海绵不经过任何处理，直接用打打出孔径为d=1.2cm，厚度h=1cm的圆柱状，保证海绵的的质量为10mg(±0.5mg)，将称好的海绵放到浓度80mM的FeCl3溶液中浸泡10min后，用镊子取出来挤压5-6次，用滤纸将海绵中的水吸干，在真空干燥箱里60℃干燥12h，就得到了络合了Fe3+的材料（MS@Fe3+）。接着纯化漆酶，称取300mg漆酶溶于水，在冷冻离心机4℃下，转速为12000rpm离心15min，取上清液冻干，放在4℃备用。称取冻干的100mg的纯化的漆酶溶于100ml、pH=4,50mM磷酸的缓冲液中，取缓冲液20ml,加入100mg的材料（MS@Fe3+），并在摇床中25℃下过夜。漆酶的上载量通过Beford法检测为每毫克固体能够固定180微克的漆酶，镊子挤压回收该固定化酶，并用pH=4,50mM磷酸的缓冲液洗涤材料3-4次,以除去材料上物理吸附的酶和溶液中未固定的游离酶。从图2为红外谱图来看，当修饰Fe3+后，材料的红外吸收并没有什么明显的变化，只有峰位有非常轻微的位移，这是由于Fe3+与海绵的络合造成的；固定酶后，发现材料上多了许多新的峰，其中2421cm-1应该为漆酶蛋白分子里-SH的伸缩振动，1164cm-1为C-O的伸缩振动，1035cm-1为N-H2的变形振动，939cm-1和876cm-1为C-S键的伸缩振动，而507cm-1为蛋白中二硫键的伸缩振动，而酶中C=O的吸收与材料上的C-N的吸收重合，变化不明显。通过图3为XPS谱图可以看出Fe3+与材料的成功结合以及漆酶的成功固定，纯的海绵（MS）是没有Fe3+的峰的，通过与FeCl3作用后，出现了Fe3+的峰，说明Fe3+确实能够与海绵上的伯胺络合，继续将修饰了Fe3+的海绵用于漆酶的固定，发现固定漆酶后，Fe3+的峰弱了许多，这是漆酶附着在材料表面覆盖了Fe3+的信号，使得漆酶附着在材料表面Fe3+的信号饱和了，因此，Fe3+的信号减弱了。从这里可以看出合成的MS@Fe3+材料并用于漆酶固定是成功的。本专利技术提供了一种直接利用蜜胺海绵上固有的伯胺与Fe3+络合固定酶的方法。固定化酶为漆酶、脂肪酶和胰蛋白酶；为了表征固定化酶的特性。本专利技术进行了以下实验研究：实验例1固定化酶的动力学方程研究通过测量在25℃，pH=4的条件下，不同底物2,2’-联氮基双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）浓度下的反应速率,计算固定化酶和游离酶的米氏方程参数，包括该固定化酶和游离酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。其中米氏常数Km表示酶与底物的亲和能力，Km越小，亲和能力越强，Vmax表示酶催化反应的最大反应速率，Vmax越大，酶的活性越强。如图4所示，固定化酶和游离酶为不同斜率的两条直线，固定化酶和游离酶的Vmax和Km值比较接近，并且固定酶的Vmax稍大于游离酶，说明静电作用对酶的构象影响很小，酶固定对酶的催化能力有一定的促进，固定化酶的Km小于游离酶，这得益于海绵超大孔的网状结构，使得酶与底物有足够的空间接触反应。实验例2固定化酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法，其步骤是：材料（MS@Fe3+）的制备购买的蜜胺海绵不经过任何处理，直接用打孔器打出孔径为d=1.2cm，厚度h=1cm的圆柱状，保证海绵的的质量为10mg，将称好的海绵放到的FeCl3溶液中浸泡10min后，用镊子取出来挤压数次，用滤纸将海绵中的水吸干，在60℃真空干燥箱里干燥12h，就得到了络合了Fe3+的材料（MS@Fe3+）；酶的固定纯化酶，称取漆酶溶于水中，在4℃下，在转速为12000 rpm冷冻离心机离心15 min，取上清液冻干，放在4℃备用；称取纯化的漆酶溶于20ml、 pH=2‑9,50 mM、50 mM的磷酸的缓冲液中，取缓冲液20ml，加入步骤a得到了络合材料（MS@Fe3+），并在摇床中25℃下过夜，酶的上载量通过Beford法检测为每毫克固体颗粒能够固定180微克的漆酶，镊子挤压回收该固定化酶，并用pH=4，50 mM磷酸的缓冲液洗涤材料数次,以除去材料上物理吸附的酶和溶液中未固定的游离酶。

【技术特征摘要】
1.一种三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法，其步骤是：材料（MS@Fe3+）的制备购买的蜜胺海绵不经过任何处理，直接用打孔器打出孔径为d=1.2cm，厚度h=1cm的圆柱状，保证海绵的的质量为10mg，将称好的海绵放到的FeCl3溶液中浸泡10min后，用镊子取出来挤压数次，用滤纸将海绵中的水吸干，在60℃真空干燥箱里干燥12h，就得到了络合了Fe3+的材料（MS@Fe3+）；酶的固定纯化酶，称取漆酶溶于水中，在4℃下，在转速为12000rpm冷冻离心机离心15min，取上清液冻干...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海霞，邹玉琳，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62