生防菌枯草芽胞杆菌Bs wy-1的发酵培养方法技术

本发明专利技术公开了生防细菌枯草芽胞杆菌Bs wy‑1的发酵培养方法，包括：将枯草芽孢杆菌接种到最适NYD液体培养基中进行发酵培养，即得。本发明专利技术在最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合的优化筛选基础上进行了培养基成分响应面试验，最终确定了NYD培养基的最佳组成。在确定了最佳培养基的配方组成后进一步对显著影响发酵产物中生防细菌芽孢杆菌活菌数的培养温度、初始pH值、接种量以及装液量的参数进行了优化。本发明专利技术采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对生防细菌进行发酵培养，结果发现优化后活菌数为9.6×10

Fermentation Culture of Biocontrol Bacillus subtilis Bs WY-1

The invention discloses a fermentation culture method of Biocontrol Bacterium Bacillus subtilis Bs WY. 1, which includes inoculating Bacillus subtilis into the optimum NYD liquid medium for fermentation culture, and obtaining. Based on the optimum screening of the optimum carbon source, nitrogen source, inorganic salt and inorganic salt combination, the present invention carries out the response test of the medium composition, and finally determines the optimum composition of the NYD medium. After determining the optimum medium composition, the parameters of culture temperature, initial pH value, inoculation volume and liquid loading volume which significantly affected the number of viable Bacillus in fermentation products were further optimized. The biocontrol bacteria are fermented by the optimized culture medium and the optimized fermentation culture conditions. The results show that the optimized number of viable bacteria is 9.6 X 10.

【技术实现步骤摘要】
生防菌枯草芽胞杆菌Bswy-1的发酵培养方法
本专利技术涉及芽孢杆菌的发酵培养方法，本专利技术进一步涉及枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)Bswy-1的发酵培养基及其发酵方法，属于枯草芽孢杆菌菌株的发酵制备领域。
技术介绍
番茄的灰霉病和叶霉病在番茄的生产过程中极为常见，给番茄的生产造成巨大的经济损失。目前，两种病害主要使用化学农药进行防治。近年来长期施用农药产生的危害受到极大的关注。相比而言，微生物农药具有无残留无公害等优点，是取代化学农药的首选。因此应用有益微生物防治番茄灰霉病和叶霉病的前景十分广阔。目前，用于防治番茄灰霉病和叶霉病的多数菌株抑菌谱单一，仅对其中的一种病害有效，能够同时防治两种病害的菌株较少，目前尚未有同时防治番茄灰霉病和叶霉病的微生物菌剂上市应用。但是，两种病害在生产过程中经常同时发生，因此，研究兼防灰霉病和叶霉病的生防菌株具有重要意义。近几年生物发酵工程在农业领域的应用十分广泛，主要是通过优化发酵工艺增加菌量及发酵代谢产物用于增产、防病等方面的研究。包括两方面：一是培养基成分的优化，二是发酵条件的优化。采用适合的优化方法，在提高生产效率的同时还能降低生产成本，应用性更强(陈坚，刘立明，堵国成，等.发酵过程优化原理与技术[M].北京：化学工业出版社，2009：1-5.)。培养基能为微生物的生长提供必须的营养和必要的生长环境。其中碳源和氮源对微生物的生长和繁殖尤为重要(姚文兵.生物技术制药概论[M].中国医药科技出版社，2010.)。碳源能为微生物的生长提供物质和能量(蒋新龙.发酵工程[M].杭州：浙江大学出版社，2011，61.)。常用的碳源主要有谷物淀粉(如玉米粉、马铃薯淀粉等)、蔗糖、糖蜜等。氮源(包括有机氮和无机氮)为微生物细胞和代谢物提供氮素，对微生物的繁殖及芽孢的形成有着重要的作用(梁宇.生防枯草芽胞杆菌S-16液体发酵条件的优化[D].内蒙古农业大学，2015.)。氮源按能否直接被菌体利用可分为速效氮和迟效氮。速效氮利于菌体的生长，迟效氮利于代谢产物的形成(张嗣良.发酵工程原理[M].北京：高等教育出版社，2013，42-43.)。C/N对微生物的生长代谢产生直接的影响，过大和过小均影响微生物的繁殖和代谢。合适的C/N对微生物的生长代谢非常重要(钱风光，陈守文，蔡皓.生防菌枯草芽胞杆菌BS-5在3L发酵罐中的发酵工艺优化[J].中国生物防治，2009，25(1)：73-78.)。无机盐是组成酶或辅酶的有效成分，对生物大分子和细胞结构的稳定性起到一定的维持作用，能够缓冲和调节菌体与培养基之间关系(杜娟，孙佰平，张学坤，等.正交设计优化以沼液为基质的枯草芽胞杆菌S37最优发酵培养基[J].石河子大学学报(自然科学版)，2012，30(6)：678-682.)。除此之外，发酵条件对微生物的影响也较大。合适的培养条件有利于提高发酵产量和质量(张文芝，郭坚华.微生物发酵工艺优化研究进展[J].广东农业科学，2013，40(6)：114-117.)。微生物的发酵过程中影响的因素较多，发酵工艺的优化决定着发酵水平高低(TANGXJ，HEGQ，CHENQH，etal.Mediumoptimizationforthepro-ductionofthermalstablebeta-glucanasebyBacillussubtilisZJF-1A5usingresponsesurfacemethodology[J].BioresourTechnol，2004，93(2)：175-181.)，一些试验技术和设计方法在培养基成分及培养条件的优化组合试验中得到广泛的应用。传统的优化法当试验因素较多以及考虑各因素之间交互作用时，试验次数就会增多，导致试验结果不准确。为了弥补缺陷，应用统计软件(诸如SAS、SPSS等统计软件)进行辅助试验优化得到了广泛的应用。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)Bswy-1对于番茄灰霉病和叶霉病有确切的防治功效，但是采用现有的发酵培养基和发酵条件对枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)Bswy-1进行发酵培养，发酵产物中活菌数较低，有待改进。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是对枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的发酵培养基和发酵条件进行优化，优化后的发酵培养基和发酵条件能够非常显著的提高枯草芽胞杆菌的活菌数。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种生防细菌枯草芽胞杆菌的发酵制备方法，包括：以NYD液体培养基为初始发酵培养基，将枯草芽胞杆菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养，即得。本专利技术以NYD、PPM、KB以及LB这四种培养基分别作为发酵培养的初始发酵培养基，结果发现枯草芽胞杆菌Bswy-1在NYD液体培养基中，30℃连续培养30h，菌数最大，为2.17×108cfu/mL。抑菌活性最强，抑菌距离达到6.50mm。此状态下的芽胞形成率最高，为81.25％。高于其它培养基。因此，本专利技术最终选择NYD培养基为枯草芽胞杆菌发酵培养的初始发酵培养基。在确定了培养基为的最优初始发酵培养基的基础上，本专利技术进一步对NYD培养基中的最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合进行了优化筛选。最适碳源的优化试验发现，Bswy-1以甘油为碳源时，两项指标均达到最大值，其次是蔗糖和可溶性淀粉。因此选择甘油为Bswy-1的最适碳源。最适氮源的优化试验结果发现，Bswy-1的氮源筛选中，以菌量为指标，从大到小排序前三的为黄豆饼粉、花生饼粉和酵母粉。以抑菌活性为指标，排序为前三的为牛肉膏、蛋白胨和花生饼粉。考虑成本等因素选花生饼粉作为最适氮源。最适无机盐的优化试验结果发现，综合两项指标的结果分析，按照从大到小排序，Bswy-1无机盐筛选排序为氯化钙＞磷酸氢二钠＞磷酸二氢钾＞NaCl＞硫酸镁＞硫酸铁＞硫酸锰＞硫酸铜。最适无机盐组合的优化试验发现，Bswy-1为前三种组合，无机盐的最佳组合是氯化钙，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。在最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合的优筛选结果的基础上，本专利技术进行了培养基成分响应面试验，最终确定了培养基的最佳组成为：甘油2.2％，花生饼粉1.24％，氯化钙0.09％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钠0.1％，余量是水。在确定了最佳培养基的配方组成后，本专利技术进一步对显著影响株发酵产物中活菌数的培养温度、初始pH值、接种量以及装液量的参数进行了优化。根据培养温度对生防细菌枯草芽胞杆菌Bswy-1株生长的优化试验结果可见，菌株在20℃，25℃，30℃和37℃4个温度下均能生长，菌株Bswy-1在37℃培养时，菌体密度和发酵液抑菌圈直径均达最大值，因此选择37℃作为菌株Bswy-1的最适培养温度。。根据初始pH值对生防细菌枯草芽胞杆菌Bswy-1株生长的优化试验结果可见，当pH为7.0时，菌株Bswy-1两项指标的值最大。因此，选择发酵培养基的起始pH值为7.0。根据接种量对生防细菌枯草芽胞杆菌Bswy-1株生长的影响试验结果可见，接种量为2％和3％时，生防细菌的菌量和发酵液抗菌活性较高，其中，接种量为2％时，生防细菌的菌量和发酵液抗菌活性为最高，因此，选2％为最适接种量。根据装液量对生防细菌枯草芽胞杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生防细菌枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的发酵制备方法，其特征在于，包括：以NYD液体培养基为初始发酵培养基，将枯草芽胞杆菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养，即得。

【技术特征摘要】
1.生防细菌枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的发酵制备方法，其特征在于，包括：以NYD液体培养基为初始发酵培养基，将枯草芽胞杆菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养，即得。2.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述NYD液体培养基中的碳源为甘油。3.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述NYD液体培养基中的氮源为花生饼粉。4.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述NYD液体培养基中的无机盐组合是氯化钙，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。5.按照权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述NYD液体培养基的组成为：甘油2.2％，花生饼粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：王傲雪，石玉莹，张淑梅，张瑶，陈秀玲，刘佳音，王迎春，孟令波，康春生，宫香余，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23