一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法技术

本发明专利技术涉及一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC‑LR快速定量方法，采用高效液相色谱仪测定刚接种后的铜绿微囊藻生长周期96h内MC‑LR浓度，同时分别在显微镜下利用血球计数板计算藻细胞数量，用紫外分光光度计对铜绿微囊藻进行680nm吸光度测定，分别建立藻毒素，吸光度及藻细胞数的正比例线性关系；在随后的藻毒素毒理实验中，通过测定生长周期96h内铜绿微囊藻的吸光度或藻细胞数量，便可定量得出同时期藻毒素MC‑LR浓度；本发明专利技术同现有技术相比，具有快速、低成本、样品损耗小和无毒害等优点，能够解决传统的铜绿微囊藻藻毒素MC‑LR定量方法中存在的效率低、成本高、样品损耗多和操作人员安全性等技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法[
]本专利技术属于环保
，具体地说是一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法。[
技术介绍
]蓝藻大量繁殖导致水体缺氧、水质变坏，蓝藻水华引起水体生物多样性急剧降低，其中蓝藻属的铜绿微囊藻是形成水华藻类之一，并且它会产生微囊藻毒素，严重威胁到其他水生生物甚至人类的健康。同时环境中各类污染物对蓝藻的生长影响错综复杂，为了有效控制蓝藻水华，对铜绿微囊藻的监控显得尤为重要。目前，对藻类藻毒素的检测方法可分为化学分析检测方法、生物学测试技术和免疫检测技术：1、化学分析检测方法代表方法：高效液相色谱法，目前对MC的检测多采用HPLC-UV(高效液相色谱-紫外联机)法，其一般分析步骤是，先将毒素进行提取和纯化，采用正相或反相色谱柱对毒素进行固相萃取分离，然后将得到的纯化毒素进行紫外检测，通过与标准毒素的出峰时间进行比较而对毒素种类进行定性鉴定，并用峰面积比较法对毒素进行定量分析，该法检测限一般为ng级。该方法是检测MC含量的常规方法之一，但此法需要采用标准毒素用来获取标准曲线和吸收峰值，而目前标准毒素的缺乏在一定程度上限制了该方法的应用。2、生物学测试技术代表方法：生物测试法，采取对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性。其优点是简便直观，能较为粗略地判断提取物是否有毒性，并具有操作简单，结果直观、快速等优点；但需要消耗较多的毒素，灵敏度和专一性不高，无法准确定量，也不能辨别毒素的异构体类型，小鼠的维持费用高、工作量大。因此，生物测试法通常只作为毒性检测的最初筛选方法，并且正日益被其他方法所取代。3、免疫检测技术代表方法：酶联免疫分析(ELISA)法，在对水中物质进行免疫检测时，最常用的方法是竞争性非均相酶联免疫法。其检测程序是先将MC抗体包被固定在酶标板上，使用时加入水样和定量的酶标记物，最后加入显色底物，进行显色测定。这种方法优点是操作简单，实验时间短，效率大大提升。但其缺点是不能很好地鉴别毒素，对于异构体会出现假阳性反应。[
技术实现思路
]本专利技术的目的就是要解决上述的不足而提供一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，该方法具有快速、低成本、样品损耗小和无毒害等优点，能够解决传统的铜绿微囊藻藻毒素MC-LR定量方法中存在的效率低、成本高、样品损耗多和操作人员安全性等技术问题。为实现上述目的设计一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，包括如下步骤：1)铜绿微囊藻藻毒素MC-LR的高效液相色谱测定：将藻液样品经过处理后，通过高效液相色谱仪，测定样品的藻毒素MC-LR浓度，其中，藻液样品均属铜绿微囊藻，在新接种后培养箱培养条件下，自接种开始生长至96h内的不同时间段取样；2)铜绿微囊藻藻液样品紫外吸光度的测定：将藻液样品移入比色皿中，利用紫外分光光度计，双蒸水调零，在680nm测出对应样品的吸光度；3)铜绿微囊藻藻液样品藻细胞数量的测定：将少许藻液样品移入血球计数板计数室，通过光学显微镜40倍下观察计数，计算出藻细胞数量；4)建立藻毒素浓度、吸光度及藻细胞数的互相联系：将步骤1)至步骤3)测定的藻毒素MC-LR浓度、吸光度以及藻细胞个数数据进行处理，并分别建立正比例线性关系。进一步地，步骤1)中，藻毒素MC-LR浓度的测定条件为流动相配比甲醇与水65:35的体积比，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，紫外检测波长为238nm，进样量为10μL，保留时间为4min。进一步地，步骤1)中，所述藻液样品为铜绿微囊藻自接种开始生长至0h、20h、40h、60h、80h、90h的藻液样品。进一步地，步骤4)中，根据建立的线性关系，在藻毒素毒理实验中，通过测定铜绿微囊藻藻液样品吸光度或藻细胞计数，即得出同时期藻毒素MC-LR浓度。进一步地，对用于毒理实验的样品铜绿微囊藻，培养1-2周，灭菌再进行接种，培养液为BG-11，接种至灭菌的锥形瓶，接种比例为1:5或1:6。本专利技术同现有技术相比，提供了一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，由于测定过程中直接测定藻液吸光度或藻细胞计数，从而根据MC-LR浓度与吸光度或藻细胞数的线性关系即可快速定量；本专利技术方法与传统的液相色谱法相比，其操作更为简单，高效快捷；与生物测试法相比，本专利技术方法无需其他动物生物介入进行测试，其操作简单、环保、快捷方便，且对操作人员无毒害作用；与酶联免疫分析法相比，本专利技术不会因区分不出异构体进行检测，交叉污染而测定不准。[附图说明]图1是本专利技术96h内各个时间点藻液样品中吸光度的曲线；图2是本专利技术96h内各个时间点藻液样品中藻细胞数的曲线；图3是本专利技术96h内藻液样品中藻毒素MC-LR与藻细胞数的曲线；图4是本专利技术96h内藻液样品中藻毒素MC-LR与吸光度的曲线；图5、图6是本专利技术96h内某两个时间点藻液样品在显微镜下血球计数板计数室的藻细胞数量。[具体实施方式]本专利技术的技术原理为：一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，即采用高效液相色谱仪测定刚接种后的铜绿微囊藻生长周期96h内MC-LR浓度，同时分别在显微镜下利用血球计数板计算藻细胞数量，用紫外分光光度计对铜绿微囊藻进行680nm吸光度测定，分别建立藻毒素，吸光度及藻细胞数的正比例线性关系。即在随后的藻毒素毒理实验中，通过测定生长周期96h内铜绿微囊藻的吸光度或藻细胞数量，便可得出同时期藻毒素MC-LR浓度。下面结合具体实施例对本专利技术作以下进一步说明：实施例1一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，具体步骤如下：(1)铜绿微囊藻藻毒素MC-LR的高效液相色谱测定取新接种铜绿微囊藻0,20,40,60,80,90h的藻液样品，将藻液样品经过处理后，通过高效液相色谱仪，测定样品的藻毒素MC-LR浓度。所述方法条件为流动相配比甲醇与水65:35的体积比，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，紫外检测波长为238nm，进样量为10μL，保留时间为4min左右。(2)铜绿微囊藻藻液样品紫外吸光度的测定取新接种铜绿微囊藻0,20,40,60,80,90h的藻液样品，将藻液样品移入比色皿中，利用紫外分光光度计，双蒸水调零，在680nm测出对应样品的吸光度。(3)铜绿微囊藻藻液样品藻细胞数量的测定取新接种铜绿微囊藻0,20,40,60,80,90h的藻液样品，将少许藻液样品移入血球计数板计数室，通过光学显微镜40倍下观察计数，计算出藻细胞数量。(4)建立藻毒素浓度，吸光度及藻细胞数的互相联系将新接种后的铜绿微囊藻生长周期96h内的每个时间点的藻液样品，通过上述步骤(1)(2)(3)中的方法，分别测出藻毒素MC-LR浓度、吸光度以及藻细胞个数，将MC-LR浓度、吸光度以及藻细胞个数数据进行处理，可分别建立正比例线性关系。(5)利用该线性关系，在以后的毒理实验中，只需对铜绿微囊藻藻液样品进行吸光度测定或细胞计数，即可定量得到相对应的藻毒素MC-LR浓度。实施例2一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，具体步骤如下：(1)对用于毒理实验的样品铜绿微囊藻培养1-2周，灭菌再进行接种，培养液为BG-11，接种至灭菌的锥形瓶，接种比例约本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC‑LR快速定量方法，其特征在于，包括如下步骤：1)铜绿微囊藻藻毒素MC‑LR的高效液相色谱测定将藻液样品经过处理后，通过高效液相色谱仪，测定样品的藻毒素MC‑LR浓度，其中，藻液样品均属铜绿微囊藻，在新接种后培养箱培养条件下，自接种开始生长至96h内的不同时间段取样；2)铜绿微囊藻藻液样品紫外吸光度的测定将藻液样品移入比色皿中，利用紫外分光光度计，双蒸水调零，在680nm测出对应样品的吸光度；3)铜绿微囊藻藻液样品藻细胞数量的测定将少许藻液样品移入血球计数板计数室，通过光学显微镜40倍下观察计数，计算出藻细胞数量；4)建立藻毒素浓度、吸光度及藻细胞数的互相联系将步骤1)至步骤3)测定的藻毒素MC‑LR浓度、吸光度以及藻细胞个数数据进行处理，并分别建立正比例线性关系。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，其特征在于，包括如下步骤：1)铜绿微囊藻藻毒素MC-LR的高效液相色谱测定将藻液样品经过处理后，通过高效液相色谱仪，测定样品的藻毒素MC-LR浓度，其中，藻液样品均属铜绿微囊藻，在新接种后培养箱培养条件下，自接种开始生长至96h内的不同时间段取样；2)铜绿微囊藻藻液样品紫外吸光度的测定将藻液样品移入比色皿中，利用紫外分光光度计，双蒸水调零，在680nm测出对应样品的吸光度；3)铜绿微囊藻藻液样品藻细胞数量的测定将少许藻液样品移入血球计数板计数室，通过光学显微镜40倍下观察计数，计算出藻细胞数量；4)建立藻毒素浓度、吸光度及藻细胞数的互相联系将步骤1)至步骤3)测定的藻毒素MC-LR浓度、吸光度以及藻细胞个数数据进行处理，并分别建立正比例线性关系。2.如权利要求1所述的铜绿微囊藻生长周期内微囊藻毒素MC-LR快速定量方法，其特征在于：步骤1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春晖，叶璟，陈佳文，黄晨，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海,31