本发明专利技术公开了氧化石墨烯在制备过继性树突状细胞功能促进剂中的应用，所述树突状细胞功能为树突状细胞成熟度和/或迁移能力。本发明专利技术发现氧化石墨烯通过体外与骨髓来源未成熟树突状细胞的共同孵育和刺激活化，提升其共刺激分子、趋化因子受体表达水平和炎症应答能力，从而促进其在体迁移及向淋巴细胞归巢能力。与细胞因子鸡尾酒相比，氧化石墨烯具有成本低廉、结构稳定、易于获得及组成相对单一的优势，更有利于在树突状细胞疫苗制备中的临床转化。
【技术实现步骤摘要】
氧化石墨烯在制备树突状细胞功能促进剂中的应用
本专利技术涉及纳米生物
，特别是涉及氧化石墨烯在制备树突状细胞，尤其是过继性树突状细胞、过继性树突状细胞疫苗功能促进剂中的应用。
技术介绍
树突状细胞(DendriticCells,DCs)是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，并且是唯一可以激活幼稚T细胞(NaiveTCells)的一类抗原递呈细胞(AntigenPresentingCells,APCs)。树突状细胞可以调动多种免疫抵抗机制，例如细胞毒T细胞、CD4+辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及自然杀伤T(NKT)细胞等。这些树突状细胞都具有识别和杀死患病细胞、以及释放保护性细胞因子(例如IFN-γ,TNF-α)的作用。在生理状态下DCs发挥抗原递呈作用需要经历两个至关重要的过程：1)对入侵病毒或细菌进行识别、吞噬及抗原处理和递呈及成熟状态转变，即趋化因子表达谱的转换及表面共刺激分子的上调表达；2)DCs离开外周组织向淋巴组织归巢，且为T细胞的激活提供第二信号。未成熟DC接受病原体相关分子模式(PAMPs)或危险信号刺激后上调趋化因子受体7(CCR7)表达，获得淋巴细胞归巢能力，一旦到达淋巴结T细胞区，成熟DC在表达于CD4+T细胞表面的CD40L的刺激下被“批准”激活。CD40信号刺激，上调DC表面共刺激分子，使DC获得最佳激活CD8+T细胞的能力。基于DCs的免疫治疗(DCs-basedimmunotherapy)，也被称为DCs疫苗，是指针对肿瘤和慢性感染性病人的免疫低下和紊乱的特点，利用生物学手段在体外对DCs进行诱导培养、抗原负载和刺激成熟，然后回输入患者体内，以达到调正免疫秩序并激活抗原特异性T细胞反应的目的。DCs疫苗往往用于患者放、化疗或造血干细胞移植、器官移植后的辅助治疗上；通过复杂的离体培养和细胞工程方法，在体外对原代细胞进行培养增殖，并将功能化的免疫细胞回输到患者体内的过程称为“过继性”，回输到患者体内的功能化DCs被称为过继性树突状细胞(简称“过继性DC”)。因此，过继性树突状细胞输注作为日趋成熟的免疫疗法在肿瘤和慢性感染性疾病的防治中将发挥越来越大的作用。过继性DC的激活和向T细胞富集区的归巢是影响DCs功能化的关键因素。DCs激活后往往上调表达其表面多种共刺激分子(如CD40,CD80,CD86等)和分泌Th1类细胞因子(IL-1β，TNF-α，IL-6等)来诱导T细胞免疫激活，而未成熟的过继性DC不仅不能活化T细胞,反而会使T细胞功能失活,诱导T细胞耐受。目前，经FDA认证的细胞因子鸡尾酒(Cytokinecocktail，IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE2)和改良细胞因子鸡尾酒(IL-1β、TNF-α、IL-6、polyI：C、CpGODN)是刺激过继性DC成熟最常用的促进剂。该促进剂能够一定程度提高过继性DC的成熟度，包括共刺激分子的上调表达和某些促炎因子的分泌。但是，该促进剂最大的缺陷是不能有效地促进过继性DC向淋巴组织归巢和迁移，大量的文献(如O’NeillD.W.et.al.Blood2004,104,2235-2246)证明仅有不到5％Cytokine-Cocktail负载DCs可经淋巴引流归巢至邻近淋巴结，这也是近几年过继性DC治疗在临床上响应率低下(10–15％)的重要原因之一。除此之外，细胞因子鸡尾酒也存在制备和生产纯化工艺复杂，成本高昂等问题。因此，开发有效的促进剂，最大程度地提高过继性DC激活的成熟程度，促进其在体迁移能力从而更多地递呈抗原给T细胞以诱发机体免疫应答，是提高其临床疗效的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供氧化石墨烯的一种新用途，即氧化石墨烯在制备树突状细胞功能促进剂中的应用，所述树突状细胞功能为树突状细胞成熟度和/或迁移能力。所述氧化石墨烯具有微观片层结构，纯度不小于99％。所述氧化石墨烯的片径尺寸为50-1500nm，优选50-500nm，更优选50-200nm。所述氧化石墨烯的片层厚度约为0.8-1.2nm。所述树突状细胞功能促进剂是通过超声将氧化石墨烯分散在溶剂或培养基中得到。所述氧化石墨烯是由石墨烯经强氧化剂(如高锰酸钾)氧化处理得到的具有微观片层结构的二维纳米材料。所述氧化石墨烯的制备过程如下：鳞状石墨、NaNO3和浓H2SO4混合后在冰浴中搅拌，加入KMnO4后35℃搅拌2h，再缓慢升温至60℃搅拌2h，然后加入200mL水中，80-90℃下搅拌5h，加入30wt％的H2O2水溶液至无气泡产生，趁热过滤后，先用5wt％的稀盐酸清洗滤饼，然后用去离子水洗涤，直至滤液呈中性且无SO42-，将滤饼冷冻干燥，得到单层氧化石墨烯。进一步将具有微观片层结构的氧化石墨烯或单层氧化石墨烯进行研磨得到氧化石墨烯粉末；再将氧化石墨烯粉末分散在去离子水中经超声处理。所述树突状细胞为未成熟树突状细胞；当所述未成熟树突状细胞为骨髓来源时，以其表面特异性表达的CD11c阳性率评价，其纯度应达到65％以上。将所述氧化石墨烯与未成熟树突状细胞共孵育以促进所述树突状细胞成熟度和/或迁移，共孵育体系中氧化石墨烯终浓度为3.9-62.5μg/mL，优选7.8-31.2μg/mL，最优选7.8-15.6μg/mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种用于树突状细胞过继性治疗的促进剂——氧化石墨烯(grapheneoxide,GO)，其作为促进剂在输注前可提升过继性树突状细胞的成熟度和输注后迁移能力，且无明显毒副作用。本专利技术利用氧化石墨烯纳米材料良好的生物相容性及片径尺寸可调等特性，将其用做促进剂能大大提高过继性DC疫苗的局部或静脉输注下的淋巴器官归巢速率和归巢效率，为树突状细胞疫苗的临床转化提供了新的选择和路径。本专利技术提出的氧化石墨烯材料的新用途采用体外筛选和评价的方式证明了其对DCs体外刺激和功能化的效果，因此，在临床使用上可获得更好的预期。附图说明图1所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯的表征结果：其中A幅为透射电镜照片，B幅为动态光散射曲线图，C幅为原子力显微镜照片；图2所示为树突状细胞经诱导培养不同时间的imDCs形态变化照片；图3所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯处理后imDCs细胞存活率图(流式图中横坐标表示Fitc标记的AnnexinV)；图4中A幅为不同片径尺寸的氧化石墨烯被DCs吞噬后的透射电镜照片，B幅为不同片径尺寸的氧化石墨烯被DCs吞噬后的瑞士-吉姆萨染色照片；图5所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯与DCs作用后DCs趋化因子受体表达水平图(注：流式图的横坐标表示荧光分子及其标记的树突状细胞表面分子；*与Ctrl-DCs组比较，#与S-DCs组比较，&与M-DCs组比较，P＜0.05)；图6所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯与DCs作用后体系中炎性细胞因子1L-6分泌水平柱状图(*与Ctrl-DCs组比较，#与S-DCs组比较，P＜0.05)；图7所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯与DCs作用后DCs表面趋化因子受体CCR7表达水平；图8所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯处理后DCs经脚垫输注后迁移能力的比较：其中A幅为脚垫输注带有萤火虫荧光素酶报告基因的imDCs后发光部位的注释图；B本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.氧化石墨烯在制备树突状细胞功能促进剂中的应用，其特征在于，所述树突状细胞功能为树突状细胞成熟度和/或迁移能力。
【技术特征摘要】
1.氧化石墨烯在制备树突状细胞功能促进剂中的应用，其特征在于，所述树突状细胞功能为树突状细胞成熟度和/或迁移能力。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述氧化石墨烯具有微观片层结构，纯度不小于99％。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述氧化石墨烯的片径尺寸为50-1500nm，优选50-500nm，更优选50-200nm。4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述氧化石墨烯的片层厚度约为0.8-1.2nm。5.根据权利要求1-4任一所述应用，其特征在于，所述树突状细胞功能促进剂是通过超声将氧化石墨烯分散在溶剂或培养基中得到。6.根据权利要求1-5任一所述应用，其特征在于，所述氧化石墨烯是由石墨烯经强氧化剂(如高锰酸钾)氧化处理得到的具有微观片层结构的二维纳米材料。7.根据权利要求1-5任一所述应用，其特征在于，所述氧化石墨烯的制备过程如下：鳞状石墨、NaNO3和浓H2SO4混合后在冰浴中搅拌，加入KMnO4后35℃搅拌2h，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小慧，周欠欠，詹林盛，何楚琳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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