一种同时检测线粒体和DNA的荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一种同时检测线粒体和DNA的荧光探针：

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测线粒体和DNA的荧光探针
本专利技术属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种DNA荧光探针，尤其涉及一种能够同时检测线粒体和DNA的荧光探针及其合成方法和应用。
技术介绍
生物细胞内存在着各种各样的细胞器，它们有着特殊的生理功能，对生命过程起着至关重要的作用。线粒体是众多的细胞器中一个非常重要的动态细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被誉为细胞的“动力工厂”，在细胞生命活动中起着重要的作用。线粒体在细胞生理和稳态中起着至关重要的作用。线粒体功能障碍会导致固有的凋亡途径，导致各种神经退行性疾病。因此，要进一步了解线粒体功能，就需要在体内成像线粒体。核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。DNA是生命遗传的重要物质，生物体中的核酸链包括单链、双链、三螺旋和四链体等多种结构，这些结构之间相互联系、转化，在机体的生长、发育和繁殖等生命过程中起着重要作用，因此DNA分子的定量分析、特异识别，对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。由于生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。荧光探针法较传统的同位素检测快速，重复性好，用样量少，无辐射，在DNA自动测序，抗体免疫分析，疾病诊断，抗癌药物分析等方面己得到广泛应用。同时，DNA分子荧光探针在新型抗癌药剂的开发和抗癌机理的研究也早有报道。因此，发展新型结构和功能的DNA探针是非常有必要的。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种同时检测线粒体和DNA的荧光探针，该探针选择性好、可识别DNA和线粒体。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种同时检测线粒体和DNA的荧光探针，简称BISEI，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。其中，吡啶盐作为线粒体定位基团，通过探针与DNA沟槽的嵌合以识别DNA分子。一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：（1）4-甲基吡啶和碘乙烷在甲醇中加热回流，反应结束后冷却至室温，蒸干溶剂，所得固体用乙醚洗涤，得化合物1：；（2）对苯二甲醛和化合物1在保护气氛下在无水乙醇中加热回流，反应结束后，乙酸乙酯萃取，萃取液以二氯甲烷:甲醇为淋洗液过硅胶柱，得化合物2：；（3）邻苯二胺和化合物2在N,N-二甲基甲酰胺中，以对甲基苯磺酸为催化剂，加热回流，反应结束后冷却至室温，用水和二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷的萃取液以二氯甲烷:甲醇为淋洗液过硅胶柱，得荧光探针：。步骤（1）中，所述4-甲基吡啶与碘甲烷的摩尔比为1:1-1.2。反应时间为12-20h。步骤（2）中，所述对苯二甲醛与化合物1的摩尔比为1:1-1.2。反应时间为12-20h。步骤（3）中，所述邻苯二胺与化合物2的摩尔比为1.8-2:1。反应时间为4-6h。步骤（2）和（3）中，所述淋洗液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。一种上述荧光探针在检测溶液或细胞中DNA的应用。一种上述荧光探针在检测细胞线粒体中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术的可检测线粒体和DNA的荧光探针是一种新型的识别DNA并能够定位线粒体的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。可以识别DNA，实现检测DNA的作用，并可以定位在线粒体。附图说明图1是化合物1的1HNMR图谱；图2是化合物2的1HNMR图谱；图3是荧光探针BISEI的1HNMR图谱；图4是荧光探针BISEI对活细胞成像图像；图5是荧光探针BISEI对CCCP处理后活细胞成像图像；图6是荧光探针BISEI对固定细胞成像图像；图7是荧光探针BISEI与商业探针MTDR对线粒体的共定位荧光成像。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1RNA荧光探针BISEI的合成（1）将1.0g(10.7mmol)的4-甲基吡啶，溶于20mL甲醇中，将碘乙烷2.5mL(10.7mmol)滴加至混合液中，加热回流15h，反应体系由淡黄色变为黄色。反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤过滤得到黄色固体即化合物1，其1HNMR图谱见图1：；（2）将0.65g(5mmol)对苯二甲醛，0.63g化合物1溶于20mL无水乙醇中。在氮气保护下加热回流15h，反应体系变为黄色。反应结束后，乙酸乙酯萃取，用二氯甲烷：甲醇（10:1）淋洗液过柱提纯得黄色固体即化合物2，其1HNMR图谱见图2：；（3）将1.2g(11.0mmol)的邻苯二胺和2.0g（5.5mmol）的化合物2以及0.9g的对甲基苯磺酸用5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，加热回流4h。反应结束后冷却至室温，用水和二氯甲烷进行萃取，用二氯甲烷：甲醇（10:1）淋洗液过柱提纯得黄色固体即荧光探针，其1HNMR图谱见图3：。实施例2荧光探针BISEI对活细胞的荧光成像配制实施例1中制备的荧光探针BISEI的DMF母液，浓度为1mM。再取2μL母液用培养基稀释至1mL，得终浓度为2μM的探针稀释液。将接种好的细胞在探针稀释液中37℃孵育30min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长404nm，发射波段570-620nm），结果如图4所示：荧光探针BISEI能够染色活细胞的细胞质，发出红色荧光。实施例3荧光探针BISEI对CCCP处理后活细胞的荧光成像配制实施例1中制备的荧光探针BISEI的DMF母液，浓度为1mM。再取2μL母液用培养基稀释至1mL，得终浓度为2μM的探针稀释液。将接种好的细胞在探针稀释液中37℃孵育30min，用PBS洗3次；再加入细胞凋亡诱导剂CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）使终浓度为20μM，处理20min后，用PBS洗3次；贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长404nm，发射波段570-620nm），结果如图5所示：与图4相比，用CCCP处理活细胞后，细胞内的红色荧光明显变弱。实施例4荧光探针BISEI对固定细胞的荧光成像配制实施例1中制备的荧光探针BISEI的DMF母液，浓度为1mM。再取2μL母液用培养基稀释至1mL，得终浓度为2μM的探针稀释液。将接种好的细胞用1mL多聚甲醛处理30min后用PBS洗3次，然后用0.5mL5%的TritonTMX-100处理3min，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长404nm，发射波段570-620nm），结果如图6所示：荧光探针BISEI能够染色固定细胞的细胞核，发出红色荧光。实施例5荧光探针BISEI与商业探针MTDR定位于线粒体的荧光成像配制实施例1中制备的荧光探针BISEI的DMF母液，浓度为1mM。再取2μL母液用培养基稀释至1mL，得终浓度为2μM的探针稀释液。商业探针MTDR配制为1mM的DMF母液。再取1μL母液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测线粒体和DNA的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种同时检测线粒体和DNA的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）4-甲基吡啶和碘乙烷在甲醇中加热回流，反应结束后冷却至室温，蒸干溶剂，所得固体用乙醚洗涤，得化合物1：；（2）对苯二甲醛和化合物1在保护气氛下在无水乙醇中加热回流，反应结束后，乙酸乙酯萃取，萃取液以二氯甲烷:甲醇为淋洗液过硅胶柱，得化合物2：；（3）邻苯二胺和化合物2在N,N-二甲基甲酰胺中，以对甲基苯磺酸为催化剂，加热回流，反应结束后冷却至室温，用水和二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷的萃取液以二氯甲烷:甲醇为淋洗液过硅胶柱，得荧光探针：。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，牛杰，刘勇，王伟珊，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37