基于流感荧光素酶报告病毒的动物模型的建立方法和应用技术

本发明专利技术公开了基于流感荧光素酶报告病毒的动物模型的建立方法和应用。该方法主要利用一种携带Gaussia荧光素酶基因的重组流感病毒感染小鼠，并通过检测小鼠肺组织荧光素酶的表达水平评价小鼠的感染程度。本发明专利技术还公开了一种基于流感荧光素酶报告病毒技术筛选和评价抗流感药物的方法。该方法主要通过检测抗病毒处理对感染小鼠肺组织荧光素酶的表达水平的影响，筛选具有预防/治疗效果的抗流感药物。本发明专利技术通过对阳性药物利巴韦林、磷酸奥司他韦的检测证明，本发明专利技术公开的方法在新型抗流感药物的筛选、研发和评价等方面具有广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
基于流感荧光素酶报告病毒的动物模型的建立方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种基于流感荧光素酶报告病毒技术的动物模型建立方法，以及利用该动物模型筛选及评价抗流感药物的方法。
技术介绍
流感病毒是引起呼吸道感染的重要致病原之一，在冬季容易地区性或全球性爆发。这些大爆发通常是由甲型流感病毒的H1N1、H3N2亚型和乙型流感病毒引起的。甲型流感病毒感染是全球流感发病及死亡的主要原因。目前，抗流感感染主要有两种方式：抗病毒药物和疫苗。抗流感的药物根据其作用机制的不同可将其分为以下几种类型：作用于神经氨酸酶(NA)的药物，奥司他韦，扎那米韦等；作用于M2离子通道的药物，金刚烷胺，金刚乙胺等；作用于病毒其他蛋白的药物以及作用于宿主的药物，利巴韦林等。其中目前临床使用最多的是奥司他韦，但是由于该药的持续使用，流感病毒对其产生了较为严重的耐药性。流感病毒每年都在变化，而每年上市的流感病毒疫苗是基于WHO的专家对可能会流行的病毒种类的预测。但这种预测并不总是对的，一旦预测错误疫苗就不会产生效果。因此，新型流感疫苗及抗流感药物的研发是一项重要课题，而动物模型在流感疫苗及抗流感药物效果评价中具有重要的作用。以病毒反向遗传学系统为基础构建的报告病毒在体内体外的病毒学研究中起到重要的促进作用，其快速、灵敏、直观等特点使得基于报告病毒技术建立的动物模型在新型疫苗及抗病毒药物的研发和评价中具有重要的意义。本专利技术提供一种以稳定携带Gaussia荧光素酶基因的重组流感病毒为基础建立流感感染动物模型的方法及评价。本专利技术将为流感病毒新型疫苗和抗病毒药物的研发、评价等应用研究提供有效的技术平台，可有效地服务于人类的医疗卫生事业。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于流感荧光素酶报告病毒的动物模型的建立方法和应用，本专利技术有助于抗流感疫苗/药物/治疗策略的开发和效果评价。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是为：1.一种携带荧光素酶报告基因的重组流感病毒的拯救与扩增。以流感病毒A/PuertoRico/8/34为背景的常规八质粒反向遗传系统由芝加哥大学BalajiManicassamy博士提供。报告基因Gaussia荧光素酶以与流感NS1融合的形式插入NS节段，并构建到相应双向启动质粒，得到重组质粒pDZ-NS1-Gluc(附图1)，该质粒同样由BalajiManicassamy博士提供。按照传统的流感病毒八质粒反向遗传系统的策略，拯救携带Gaussia荧光素酶报告基因的重组流感病毒(PR8-NS1-Gluc)，并于八日龄鸡胚中扩增。2.一种基于流感荧光素酶报告病毒技术建立流感病毒感染动物模型的方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)将病毒液用PBS稀释至每30μlPBS中含有1000TCID50的PR8-NS1-Gluc病毒；(2)将4-6周龄雌性BALB/c小鼠利用异氟烷呼吸麻醉，取30μl稀释的PR8-NS1-Gluc病毒液滴鼻感染小鼠；(3)分别于感染后1至8天，每天处死3只小鼠并解剖，取肺组织，加500ulPBS匀浆处理；(4)取50μl肺组织匀浆，用PBS稀释至1ml，从中取20μl利用BioLuxGaussiaLuciferaseAssayKit(NEB)按照说明书指导测定荧光素酶活性；(5)测定的Gluc信号值代表小鼠肺组织荧光素酶的表达水平，根据Gluc信号值的高低评价动物模型的建模效果。3.一种利用基于流感荧光素酶报告病毒技术建立的流感感染动物模型筛选抗流感病毒感染药物的方法，按照以下步骤进行：(1)将病毒液用PBS稀释至每30μlPBS中含有1000TCID50的PR8-NS1-Gluc病毒；(2)将4-6周龄雌性BALB/c小鼠利用异氟烷呼吸麻醉，取30μl稀释的PR8-NS1-Gluc病毒液滴鼻感染小鼠；(3)于感染后2天，处死小鼠并解剖，取肺组织，加500ulPBS匀浆处理；(4)取50μl肺组织匀浆，用PBS稀释至1ml，取20μl利用BioLuxGaussiaLuciferaseAssayKit(NEB)按照说明书指导测定荧光素酶活性；(5)筛选使小鼠肺组织荧光素酶的Gluc信号值降低的药物，从而获得抗流感感染阳性药物；上述方法中还包含给药步骤，所述给药步骤分为预防给药和治疗给药两种方式，选择其中一种方式进行，其操作方法为：预防给药：初始给药时间为感染前2小时，每天给药两次，间隔12小时，持续给药2天，给药方式为灌胃；治疗给药：初始给药时间为感染后6小时和/或24小时，每天给药两次，间隔12小时，持续给药至实验结束，给药方式为灌胃；以PBS处理组做阴性对照。4.基于流感荧光素酶报告病毒评价抗流感药物/治疗策略效果的方法。本专利技术选择两种已知的抗流感药物利巴韦林及磷酸奥司他韦来检测这两种药物对流感的治疗效果。选择4-6周龄雌性BALB/c小鼠，经异氟烷麻醉后，以含有1000TCID50PR8-NS1-Gluc的30μlPBS滴鼻感染小鼠。感染后两天，解剖小鼠并采集其肺组织，测定其荧光素酶表达水平。并以Gluc信号值的降低作为评价药物治疗效果的指标。药物处理方案：(1)预防组。于感染前2小时给药，给药方式为灌胃。利巴韦林浓度为80mg/kg/day，磷酸奥司他韦选择两个浓度，分别为50mg/kg/day及20mg/kg/day。每天给药两次，持续两天。(2)治疗组。分别于感染前2小时、感染后6小时及24小时给药，给药方式为灌胃。药物选择磷酸奥司他韦，药物浓度为20mg/kg/day。每天给药两次，直到感染后两天。本专利技术与现有技术相比，有以下优点：1.减少实验动物用量。大多数传统的流感感染动物模型(致死剂量)一般需要10-12只小鼠每组，以保证实验结果的可靠性。而本模型仅需4-5只小鼠每组即可得具有统计学意义的实验结果。2.减少实验时间。大多数传统的流感感染动物模型(致死剂量)需要持续观测10-14天。本模型仅需感染后两天。3.荧光素酶活性测量方法简单。荧光素酶活性测定通过试剂盒可在10分钟内完成测定。而传统的肺部病毒载量测定则需要空斑试验或TCID50测定，需要3-5天的时间。4.小鼠肺部荧光素酶表达在感染后第二天即能够灵敏的反应药物对小鼠的保护效果。而其他参数如肺部病毒载量的变化、肺指数的变化、体重的变化则做不到这一点。5.经济。由于优点1和优点2，本模型在实验动物数量及饲养时间等方面比较节约，此外对于药物的用量也相应缩减。有效缩减了药物购买或合成所需的成本。因此，以本专利技术为基础，将为新型流感疫苗、抗流感药物或流感治疗策略的研发提供优化的评价方案和指标。本专利技术具有十分重要的理论意义和应用价值。附图说明图1为一种携带Gaussia荧光素酶基因的重组流感病毒的构建策略；图2为PR8-NS1-Gluc在MDCK细胞的生长曲线，及Gluc信号与病毒滴度、初始感染剂量相关性示意图；图3为PR8-NS1-Gluc分别以不同感染剂量感染BALB/c雌性小鼠导致小鼠体重下降情况及存活情况；图4为PR8-NS1-Gluc感染小鼠后报告基因在不同组织(肺、肝、脾)中的表达特异性；图5为PR8-NS1-Gluc感染小鼠其肺组织HE染色示意图；图6为PR8-NS1-Gluc分别以103和105TCID50感染小鼠后肺组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用流感病毒建立流感病毒感染动物模型的方法。

【技术特征摘要】
1.一种利用流感病毒建立流感病毒感染动物模型的方法。2.一种基于流感荧光素酶报告病毒技术的动物模型建立方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)将病毒液用PBS稀释至每30μlPBS中含有1000-100000TCID50的PR8-NS1-Gluc病毒；(2)将4-6周龄雌性BALB/c小鼠利用异氟烷呼吸麻醉，取30μl稀释的PR8-NS1-Gluc病毒液滴鼻感染小鼠；(3)分别于感染后1至8天，每天处死3只小鼠并解剖，取肺组织，加500ulPBS匀浆处理；(4)取50μl肺组织匀浆，用PBS稀释至1ml，从中取20μl利用BioLuxGaussiaLuciferaseAssayKit按照说明书指导测定荧光素酶活性；(5)测定的Gluc信号值代表小鼠肺组织荧光素酶的表达水平，根据Gluc信号值的高低评价动物模型的建模效果。3.一种利用基于流感荧光素酶报告病毒技术建立的流感感染动物模型筛选抗流感病毒感染药物的方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)将病毒液用PBS稀释至每30μlPBS中含有10...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜瑞坤，崔清华，杨勇，荣立军，张颖颖，李萍，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东,37