基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法，包括骨脱细胞支架制备、骨脱细胞支架脱细胞效果评价、钴60辐照灭菌、人多发性骨髓瘤细胞接种等步骤。本发明专利技术提供了一种人多发性骨髓瘤微环境模型的建立方法，解决目前多发性骨髓瘤模型难以模拟体内真实环境的问题，为多发性骨髓瘤疾病的进一步研究提供了一种细胞模型。

【技术实现步骤摘要】
基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法
本专利技术涉及一种人多发性骨髓瘤微环境模型建立的方法，属于肿瘤细胞微环境模型的建立

技术介绍
多发性骨髓瘤（Multiplemyeloma，MM）是浆细胞异常增生的恶性B细胞克隆性疾病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，是继非霍奇金淋巴瘤之后血液系统第二常见的恶性肿瘤。该病在过去的几十年里发病率逐渐上升，占所有恶性血液病的10%，存活率仅约35%，临床表现为骨痛骨折、贫血和肾功能损害等，严重影响病人的生活质量。多发性骨髓瘤起病较缓，早期无明显症状，容易误诊及漏诊，常因骨痛骨折来院就诊时被发现，绝大多数病人可见多发性的溶骨性损害。在多发性骨髓瘤发生发展的过程中，肿瘤细胞与其微环境相互作用相互影响。骨髓瘤细胞对于骨环境的重塑具有一定的作用，骨髓瘤细胞分泌破骨细胞活性因子、激活破骨细胞，使得骨质溶解、破坏。骨质的破坏常会导致病人腰骶、胸骨、肋骨疼痛，以及病理性骨折的发生。目前骨骼X线检查也是多发性骨髓瘤的常规检查项目之一，而一些低磷性骨病、骨转移癌以及严重的骨质疏松疾病在临床上则需要与多发性骨髓瘤的骨质破坏进行鉴别。骨微环境中的各种细胞外基质成分对于骨髓瘤细胞的生长与发育也发挥了重要的作用，骨是多发性骨髓瘤细胞生长的首选位置，骨的细胞外基质成分以及骨内膜的空间结构构成的小生境可调节骨髓瘤细胞的生长与发育、静息与激活过程。研究发现肿瘤的发生与发展已不单纯是肿瘤“种子”细胞的活动过程，微环境这个“土壤”是否适宜其生长可能对于肿瘤的形成更加关键。同时由于多发性骨髓瘤细胞属于悬浮生长的一类细胞，生长方向与贴壁细胞不同，呈现三维立体伸展，常规的二维培养不能满足其生长特性，在二维环境下培养的多发性骨髓瘤细胞生物属性可能被部分改变，不能反映出体内真实的肿瘤特征，这将极大的限制了多发性骨髓瘤相关研究的进展；多发性骨髓瘤的体内模型——动物模型，虽然贴近人体内肿瘤细胞生长状况，但操作繁琐、成模时间长、花费大、可控性较差，为下游机制研究造成了一定的难度。目前人们希望能够通过新技术建立体外多发性骨髓瘤三维培养模型以弥补目前的不足，2018年有报道运用骨生物材料通过3D打印技术可以构建多发性骨髓瘤3D体外培养模型，但该方法对于骨内微环境只能高度模拟，骨细胞外基质成分非天然，与真实的骨内环境还存在一定的差距（BrahamMVJ,AhlfeldT,AkkineniAR,MinnemaMC,DhertWJA,ÖnerFC,RobinC,LodeA,GelinskyM,AlblasJ.EndostealandPerivascularSubnichesina3DBoneMarrowModelforMultipleMyeloma.TissueEngPartCMethods.2018Apr18.doi:10.1089/ten.TEC.2017.0467.）。还有一些多发性骨髓瘤3D模型主要是通过在生物材料或生物反应容器中共培养多发性骨髓瘤细胞及骨髓中的其他一种或多种细胞，以研究细胞与细胞之间的相互作用，但对于细胞与细胞外基质成分之间相互作用的研究目前的模型无法运用（BelloniD,HeltaiS,PonzoniM,VillaA,VerganiB,PecciariniL,MarcattiM,GirlandaS,TononG,CiceriF,Caligaris-CappioF,FerrariniM,FerreroE.Modelingmultiplemyeloma-bonemarrowinteractionsandresponsetodrugsina3Dsurrogatemicroenvironment.Haematologica.2018Apr;103(4):707-716.）。脱细胞支架技术经由化学和物理的方法将组织中的细胞去除，形成了无免疫原性或低免疫原性的组织工程支架，保留了组织中的天然细胞外基质成分及空间结构。本模型中经过脱细胞处理，大鼠颅骨骨片上的大鼠骨细胞被去除，仅存有骨的细胞外基质成分，包括I型胶原、骨粘连素、纤维粘连素、骨钙素、蛋白多糖类以及无机物等，且保留了骨内的立体空隙结构，与人体内骨的细胞外基质成分及空间结构类似，为研究骨环境与多发性骨髓瘤细胞的相互作用提供了一个更贴近体内的小生境。因此基于骨脱细胞支架技术建立一种靶向骨髓瘤细胞微环境且更适合于多发性骨髓瘤细胞悬浮生长的体外三维立体培养模型十分有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种解决目前多发性骨髓瘤模型难以模拟体内真实环境的问题，为多发性骨髓瘤疾病的进一步研究提供一种细胞模型的基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法。本专利技术的技术解决方案是：一种基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法，其特征是：包括下列步骤：（1）骨脱细胞支架制备无菌消毒后，取已处死大鼠的颅骨骨片后双蒸水冲洗、洗脱剂混合溶液摇床震荡洗涤、双蒸水冲洗去除残余试剂，得到骨脱细胞支架；（2）骨脱细胞支架脱细胞效果评价对骨脱细胞支架进行DNA残余量检测、HE染色、超微结构观察评价；（3）钴60辐照灭菌将干燥的脱细胞骨片进行钴60辐照灭菌，完成灭菌后无菌条件下浸泡于含有10%胎牛血清的DMEM或1640完全培养基的24孔细胞培养板中12h；（4）人多发性骨髓瘤细胞接种将人多发性骨髓瘤细胞按照2×104个/cm2的密度接种于骨片上，10%胎牛血清DMEM或1640完全培养基，37℃、5%CO2条件下培养72h，建立得到基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型。还对步骤（4）得到的基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型进行模型评价，包括HE染色、DAPI染色、超微结构观察评价、CCK8法检测、细胞活力检测。所述的人多发性骨髓瘤细胞为悬浮细胞，包括U266、H929、RPMI8226、JJNK3、ARH-77、KMS-11的悬浮生长的人多发性骨髓瘤细胞株，接种密度为2×104个/cm2。洗脱剂混合溶液为TritonX-100、十二烷基硫酸钠、氨水、DNA酶、RNA酶、乙二胺四乙酸二钠、脱氧胆酸钠中的二种或二种以上；震荡洗脱时间为3-4周，3天换一次洗脱液，摇床震荡速度为100转/分钟。洗脱剂混合溶液为1%SDS+0.15%氨水组合。钴60辐照灭菌剂量为6-12kGy。本专利技术提供了一种人多发性骨髓瘤微环境模型的建立方法，解决目前多发性骨髓瘤模型难以模拟体内真实环境的问题，为多发性骨髓瘤疾病的进一步研究提供了一种细胞模型。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1是SD大鼠颅骨骨片脱细胞处理前形态图。图2是SD大鼠颅骨骨片脱细胞处理后形态图。图3是脱细胞组与未脱细胞组骨片DNA含量图。图4是脱细胞组与未脱细胞组骨片DNA1%琼脂糖凝胶电泳图。图5是HE染色观察未脱细胞组骨片基质图像。图6是HE染色观察脱细胞组骨片基质图像。图7是DAPI染色观察脱细胞骨片上人多发性骨髓瘤细胞定植图像。图8是DAPI染色观察未种植细胞组的脱细胞骨片图像。图9是CCK8检测脱细胞骨片上人多发性骨髓瘤细胞增殖情况示意图。具体实施方式（1）骨脱细胞支架制备将已处死的健康成年SD大鼠，取颅骨，去除软组织，将颅骨剪成0.5cm2大小的骨片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法，其特征是：包括下列步骤：（1）骨脱细胞支架制备无菌消毒后，取已处死大鼠的颅骨骨片后双蒸水冲洗、洗脱剂混合溶液摇床震荡洗涤、双蒸水冲洗去除残余试剂，得到骨脱细胞支架；（2）骨脱细胞支架脱细胞效果评价对骨脱细胞支架进行DNA残余量检测、HE染色、超微结构观察评价；（3）钴60辐照灭菌将干燥的脱细胞骨片进行钴60辐照灭菌，完成灭菌后无菌条件下浸泡于含有10%胎牛血清的DMEM或1640完全培养基的24孔细胞培养板中12h；（4）人多发性骨髓瘤细胞接种将人多发性骨髓瘤细胞按照2×104个/cm2的密度接种于骨片上，10%胎牛血清DMEM或1640完全培养基，37℃、5% CO2条件下培养72h，建立得到基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型。

【技术特征摘要】
1.一种基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法，其特征是：包括下列步骤：（1）骨脱细胞支架制备无菌消毒后，取已处死大鼠的颅骨骨片后双蒸水冲洗、洗脱剂混合溶液摇床震荡洗涤、双蒸水冲洗去除残余试剂，得到骨脱细胞支架；（2）骨脱细胞支架脱细胞效果评价对骨脱细胞支架进行DNA残余量检测、HE染色、超微结构观察评价；（3）钴60辐照灭菌将干燥的脱细胞骨片进行钴60辐照灭菌，完成灭菌后无菌条件下浸泡于含有10%胎牛血清的DMEM或1640完全培养基的24孔细胞培养板中12h；（4）人多发性骨髓瘤细胞接种将人多发性骨髓瘤细胞按照2×104个/cm2的密度接种于骨片上，10%胎牛血清DMEM或1640完全培养基，37℃、5%CO2条件下培养72h，建立得到基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型。2.根据权利要求1所述的基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型的构建方法，其特征是：还对步骤（4）得到的基于骨脱细胞支架的人多发性骨髓瘤微环境模型进行模型评价，包括HE染色...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚菁，李晓红，郭益冰，徐联成，姚俊中，陆晶晶，申娴娟，朱慧，鞠少卿，顾志峰，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32