一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法技术

本发明专利技术公开一种肿瘤细胞中周细胞的分离和仿生培养方法，涉及肿瘤生物学领域。本发明专利技术方法突破了以往只用两种非特异性抗体标记周细胞的方法；首次用10个抗体标记(5个阳性标记，5个阴性标记)针对周细胞进行了分离、纯化和鉴定。并在显微镜下通过形态鉴定，可以明显看出周细胞在仿生基质培养基中可形成微管，这点符合周细胞的形态特征，并重现周细胞在体内的生长，为其进一步的功能研究奠定了基础。

Isolation and bionic culture of pericytes in tumor tissue

The invention discloses a method for isolation and bionic culture of pericytes in tumor cells, which relates to the field of tumor biology. The method breaks through the previous method of labeling peripheral cells with only two non-specific antibodies, and for the first time, 10 antibody labels (5 positive labels, 5 negative labels) were used to isolate, purify and identify peripheral cells. By morphological identification under microscope, it can be clearly seen that pericytes can form microtubules in biomimetic medium, which conforms to the morphological characteristics of pericytes, and reproduces the growth of pericytes in vivo, laying a foundation for further functional research.

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法
本专利技术涉及肿瘤生物学领域，特别涉及一种肿瘤细胞中周细胞的分离和仿生培养方法。
技术介绍
周细胞是广泛分布于全身微血管壁的结构细胞，和内皮细胞一起构成微血管和组织间隙的屏障(1)。周细胞通过细胞连接或旁分泌信号与微血管内皮细胞对话，在调控微循环血流量、微血管通透性及血管新生等方面发挥重要作用。此外，在肿瘤组织中，周细胞被证明可以介导内皮成熟和稳定性并减少血管渗漏的功能性细胞。多种疾病的微血管病变伴随周细胞结构和功能异常，周细胞的调控成为研究热点。基于其形态，周细胞经常与血管平滑肌细胞(vSMC)，成纤维细胞，巨噬细胞，甚至上皮细胞的混淆。虽然目前普遍采用与vSMC相同的细胞标记，但并没有特异性抗体标记可以明确识别周细胞。通常应用的细胞标记很大程度上不能成功区分周细胞与其他血管细胞。因此，作为折中的周细胞鉴定方法通常是使用位置、形态学和基因/蛋白质表达模式的综合标准来定义或描述。最近的几篇综述提供了周细胞分子标记的列表。但是，从实际角度来看，并非所有标记都是有用的(2)。同样重要的是，没有单一的完全周细胞特异性标记物是已知的，并且目前使用的所有标记物都在其表达动态，并且可能与发育状态，病理反应，体外培养等一起下调(3)。因此内皮细胞的阴性标记以及两种或更多种周细胞标记物的组合就成为必需。表1提供了目前验证和经常使用的周细胞标记物列表。由于周细胞的形态与成纤维细胞相似，因此很难明确鉴定，目前用于人周细胞的标记抗体(表1)。但是这些抗体都不是周细胞的特异性抗体，它们在其他细胞中(例如：内皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞等)也有表达(4-6)，因此周细胞鉴定是个技术难题。此外，周细胞在培养过程中，容易分化为成纤维细胞，寻找其适宜的环境也是亟待解决的难题。表1鼠周细胞标记物参考文献：1.ArmulikA,GenovéG,BetsholtzC.Pericytes:developmental,physiological,andpathologicalperspectives,problems,andpromises.[J].DevelopmentalCell,2011,21(2):193.2.Ozerdem,U.,Grako,K.A.,Dahlin-Huppe,K.,etal.NG2proteoglycanisexpressedexclusivelybymuralcellsduringvascularmorphogenesis.Dev.Dyn.2001,222,218–227.3.WinklerF,KozinSV,TongRT,etal.KineticsofvascularnormalizationbyVEGFR2blockadegovernsbraintumorresponsetoradiation:Roleofoxygenation,angiopoietin-1,andmatrixmetalloproteinases[J].CancerCell,2004,6(6):553-63.4.NehlsV,DrenckhahnD.Theversatilityofmicrovascularpericytes:frommesenchymetosmoothmuscle？[J].Histochemistry,1993,99(1):1-12.5.GeraldesP,HiraokayamamotoJ,MatsumotoM,etal.ActivationofPKC-|[delta]|andSHP-1byhyperglycemiacausesvascularcellapoptosisanddiabeticretinopathy[J].NatureMedicine,2009,15(11):1298-1306.6.GerhardtH,SembH.Pericytes:gatekeepersintumourcellmetastasis？[J].JournalofMolecularMedicine-jmm,2008,86(2):135-144.
技术实现思路
为了克服现有周细胞没有特定抗体标记、难以鉴定的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种通过抗体标记从而鉴定和分离肿瘤组织中周细胞的的方法。该方法是一种基于多种抗体同时标记鉴定、分离纯化周细胞的方法。此外如果在普通培养瓶中培养周细胞，那周细胞将失去其在正常环境下的生长形态，从而分化为其他细胞(比如成纤维细胞)，为了在培养过程中模拟周细胞的生长环境，本专利技术提供了一种涂层仿生培养。为了研究肿瘤组织中周细胞是如何促进内皮细胞形成血管的过程，我们首先要从肿瘤组织中提取分离到纯度高的周细胞。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法，所有分离操作均在超净台中进行，包括如下步骤：(1)取新鲜的肿瘤组织样本，用生理盐水冲洗至无血色为止，并除去凝固的血；(2)将组织剪碎；(3)将酶解液加入至剪碎后的组织中，然后打碎组织，酶解完后加DMEM全培终止反应；所述的酶解液为：包含DMEM培养基，1～2.5％(g/100mL)胶原蛋白酶TypeⅠ，1～2.5％胶原蛋白酶TypeⅢ，1～2.5％胶原蛋白酶TypeⅣ和0.5～1.5％的DNA酶；设置温度37℃；酶解时间为0.5～2小时；(4)酶解完后离心，吸去上层脂肪组织，剩余液体加生理盐水重悬，静置，细胞滤网初滤；所述的细胞滤网的孔径为150～200μm；优选为200μm；(5)离心，弃上清，加生理盐水重悬；用生理盐水润湿过的细胞筛网，过滤细胞；所述的细胞筛网的孔径为70～100μm；优选为100μm；(6)过滤后的细胞再用细胞筛网过滤；除去滤液，将筛网上层未滤过的细胞移出；所述的细胞筛网的孔径为40μm；(7)离心，除去上清；加入PBS缓冲液重悬细胞，数细胞；(8)采用流式分选对周细胞和内皮细胞进行标记并鉴定；选择了10个抗体(阳性标记包括：CD13，CD140b，CD146，NG2，alphaSMA,；阴性标记包括：CD31，CD34，CD11b，CD140a，CD45)分别作为周细胞的阳性和阴性鉴定；3个抗体作为内皮细胞的鉴定抗体(阳性标记包括：CD31，CD34；阴性标记包括：CD45)；每个反应体系5×105个细胞；避光加入抗体和DAPI染料后涡旋混匀，4℃避光反应30～60分钟(优选为60分钟)；每隔15分钟轻弹管壁，以促使其完全反应；孵育后的样品加PBS缓冲液洗两次，离心；弃去上清加入PBS缓冲液进行流式分选；(9)以制备12mL培养涂层溶液为例，取90～120μL30μg/mL胶原蛋白溶液和20～40μL纤连因子加入到11.84～11.89mL0.1％明胶溶液中，轻微摇晃以铺平板；铺上涂层后的培养板置于37℃培养箱中培养30～60min后，放入4℃凝固16小时以上；在接种细胞之前立即吸出过量的溶液，用少量培养基简单冲洗以中和酸度；(10)流式分选后的周细胞，加入周细胞培养基PM，置入有涂层的培养板中，37℃培养；注：培养期间不要换液；(11)培养后通过观察，确定其为周细胞。步骤(1)中所述的新鲜的肿瘤组织样本是指存放于含1％青链双抗(v/v)和0.2％肝素(v/v)的生理盐水中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法，其特征在于：所有分离操作均在超净台中进行，包括如下步骤：(1)取新鲜的肿瘤组织样本，用生理盐水冲洗至无血色为止，并除去凝固的血；(2)将组织剪碎；(3)将酶解液加入至剪碎后的组织中，然后打碎组织，酶解完后加DMEM全培终止反应；所述的酶解液为：包含DMEM培养基，1～2.5％胶原蛋白酶Type Ⅰ，1～2.5％胶原蛋白酶Type Ⅲ，1～2.5％胶原蛋白酶TypeⅣ和0.5～1.5％的DNA酶；设置温度37℃；酶解时间为0.5～2小时；(4)酶解完后离心，吸去上层脂肪组织，剩余液体加生理盐水重悬，静置，细胞滤网初滤；所述的细胞滤网的孔径为150～200μm；(5)离心，弃上清，加生理盐水重悬；用生理盐水润湿过的细胞筛网，过滤细胞；所述的细胞筛网的孔径为70～100μm；(6)过滤后的细胞再用细胞筛网过滤；除去滤液，将筛网上层未滤过的细胞移出；所述的细胞筛网的孔径为40μm；(7)离心，除去上清；加入PBS缓冲液重悬细胞，数细胞；(8)采用流式分选对周细胞和内皮细胞进行标记并鉴定；选择了10个抗体分别作为周细胞的阳性和阴性鉴定；3个抗体作为内皮细胞的鉴定抗体；每个反应体系5×105个细胞；避光加入抗体和DAPI染料后涡旋混匀，4℃避光反应30～60分钟；每隔15分钟轻弹管壁，以促使其完全反应；孵育后的样品加PBS缓冲液洗两次，离心；弃去上清加入PBS缓冲液进行流式分选；所述的10个抗体为阳性标记包括：CD13，CD140b，CD146，NG2，alpha SMA；阴性标记包括：CD31，CD34，CD11b，CD140a，CD45；所述的3个抗体为阳性标记包括：CD31，CD34；阴性标记包括：CD45；(9)以制备12mL培养涂层溶液为例，取90～120μL 30μg/mL胶原蛋白溶液和20～40μL纤连因子加入到11.84～11.89mL 0.1％明胶溶液中，轻微摇晃以铺平板；铺上涂层后的培养板置于37℃培养箱中培养30～60min后，放入4℃凝固16小时以上；在接种细胞之前立即吸出过量的溶液，用少量培养基简单冲洗以中和酸度；(10)流式分选后的周细胞，加入周细胞培养基PM，置入有涂层的培养板中，37℃培养；注：培养期间不要换液；(11)培养后通过观察，确定其为周细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法，其特征在于：所有分离操作均在超净台中进行，包括如下步骤：(1)取新鲜的肿瘤组织样本，用生理盐水冲洗至无血色为止，并除去凝固的血；(2)将组织剪碎；(3)将酶解液加入至剪碎后的组织中，然后打碎组织，酶解完后加DMEM全培终止反应；所述的酶解液为：包含DMEM培养基，1～2.5％胶原蛋白酶TypeⅠ，1～2.5％胶原蛋白酶TypeⅢ，1～2.5％胶原蛋白酶TypeⅣ和0.5～1.5％的DNA酶；设置温度37℃；酶解时间为0.5～2小时；(4)酶解完后离心，吸去上层脂肪组织，剩余液体加生理盐水重悬，静置，细胞滤网初滤；所述的细胞滤网的孔径为150～200μm；(5)离心，弃上清，加生理盐水重悬；用生理盐水润湿过的细胞筛网，过滤细胞；所述的细胞筛网的孔径为70～100μm；(6)过滤后的细胞再用细胞筛网过滤；除去滤液，将筛网上层未滤过的细胞移出；所述的细胞筛网的孔径为40μm；(7)离心，除去上清；加入PBS缓冲液重悬细胞，数细胞；(8)采用流式分选对周细胞和内皮细胞进行标记并鉴定；选择了10个抗体分别作为周细胞的阳性和阴性鉴定；3个抗体作为内皮细胞的鉴定抗体；每个反应体系5×105个细胞；避光加入抗体和DAPI染料后涡旋混匀，4℃避光反应30～60分钟；每隔15分钟轻弹管壁，以促使其完全反应；孵育后的样品加PBS缓冲液洗两次，离心；弃去上清加入PBS缓冲液进行流式分选；所述的10个抗体为阳性标记包括：CD13，CD140b，CD146，NG2，alphaSMA；阴性标记包括：CD31，CD34，CD11b，CD140a，CD45；所述的3个抗体为阳性标记包括：CD31，CD34；阴性标记包括：CD45；(9)以制备12mL培养涂层溶液为例，取90～120μL30μg/mL胶原蛋白溶液和20～40μL纤连因子加入到11.84～11.89mL0.1％明胶溶液中，轻微摇晃以铺平板；铺上涂层后的培养板置于37℃培养箱中培养30～60min后，放入4...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳培，孟琼，朱晓峰，陈学曼，孟亚明，赵新保，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东,44