一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。本发明专利技术建立了以金属钌配合物做为荧光染料进行实时荧光定量PCR的检测方法，结果显示，金属钌配合物做为荧光染料可在一个较宽浓度范围内使用，并可生成熔解曲线进行特异性扩增验证以及多重PCR检测，同时具有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优点，可进行大面积推广及应用。

A real-time fluorescence quantitative PCR detection method and kit based on ruthenium complexes

The invention discloses a real-time fluorescence quantitative PCR detection method and a kit based on metal ruthenium complex. The method for real-time quantitative fluorescence PCR using ruthenium metal complexes as fluorescent dyes is established. The results show that ruthenium metal complexes as fluorescent dyes can be used in a wide concentration range, and melting curves can be generated for specific amplification verification and multiplex PCR detection. At the same time, the method has high sensitivity. The advantages of wide linear range and low cost can be widely promoted and applied.

【技术实现步骤摘要】
一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒
本专利技术涉及一种PCR检测方法及其应用，特别涉及将金属钌配合物应用于核酸扩增检测体系中，如用于实时荧光定量PCR(qPCR)的检测方法。
技术介绍
核酸扩增检测对环境检测以及食品质量与安全等领域具有十分重要的意义。聚合酶链式反应(PCR)通过体外扩增产生大量特定核酸序列，已经广泛应用于分子生物学检测中。传统聚合酶链式反应常需要电泳来进行扩增产物验证，费时费力，无法定量起始模板浓度，且容易造成扩增子污染。为克服电泳法终点检测的缺点，开发了实时荧光定量PCR技术，每轮PCR循环产生相应的荧光信号，再通过分析已知标准品的循环阈值获得标准曲线，可对未知样品中核酸浓度实现精确计算。实时荧光定量PCR主要分为DNA结合染料法和探针法，探针法具有较强的特异性，不需PCR后处理，但需要根据特定序列合成探针，成本相对较高；荧光DNA结合染料在溶液中几乎不发荧光，当结合到DNA上时发强荧光，并与PCR产生的DNA总量成正比。DNA结合染料以一种非序列特异性结合到DNA双链上，因此不需要根据特定序列合成探针，成本相对较低，但是非特异性扩增产物同样也会产生荧光信号，需要通过测量扩增产物的熔解曲线鉴别PCR扩增产物的特异性。目前在实时荧光定量PCR中常用的较成熟的染料如SYBRGreenI和EvaGreen是成本较高的进口商品化试剂。且应用最广泛的SYBRGreenI在扩增的过程中存在对反应产生较大的抑制以及信噪比较低等问题，在应用中还发现SYBRGreenI在高温以及光源激发时存在稳定性较差的现象。所以，有必要开发经济环保、光稳定性好、实用性强的新型荧光染料应用于核酸检测和便携试剂盒中。有报道将金属钌配合物核酸分子“光开关”，例如钌多吡啶配合物([Ru(phen)2(dppz)]2+、[Ru(bpy)2(dppz)]2+，dppz＝dipyrido[3,2-a:2’,3’-c]phenazine,bpy＝2,2’-bipyridine,phen＝1,10-phenanthroline)应用于核酸检测，并且也具有一些优于其它有机结合染料的性质，例如荧光背景低、水溶性强、斯托克斯(stokes)位移大等优点(详见参考文献：J.Am.Chem.Soc.1990,112,4960；MicrochemicalJournal1999,63,356；MicrochimicaActa2000,134,57；AnalyticaChimicaActa2000,403,209；AnalyticaChimicaActa2001,436,207；DaltonTransactions2016,45,13261)。还有研究表明，钌金属配合物可以用于凝胶电泳分析PCR扩增产物的荧光染料(MethodEnzymol.1993,226,576)。但是，在实时PCR分析领域目前尚未见到其应用的研究和报道，原因包括：1)目前金属钌配合物的研究主要集中在生物无机化学领域，而PCR反应体系具有自身特点，进行实时PCR扩增研究还需要有分子生物学的背景，属于交叉学科研究领域；2)由于金属钌配合物特殊的荧光性质，并不是市面上所有的实时PCR仪都能够高灵敏的检测出它们的荧光信号，硬件上的要求在一定程度上限制了研究人员在PCR分析领域对金属钌配合物的应用展开研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：本专利技术的一个目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分；以拷贝数不同的多个核酸样品作为标准品，将各标准品分别作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序分别进行实时荧光定量PCR，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线；以未知拷贝数的核酸样品作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序进行实时荧光定量PCR，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的DNA拷贝数。优选的，所述金属钌配合物在实时荧光定量PCR反应体系中的终浓度为0.5-10μM。所述反应体系的终体积为10-20μL。优选的，所述金属钌配合物选自[Ru(phen)2(dppz)]2+、[Ru(bpy)2(dppz)]2+等钌多吡啶配合物中的一种。为了增强qPCR分析性能，或选自对钌多吡啶配合物的phen、bpy、dppz等配体进行进一步结构修饰获得的其它具有核酸分子光开关行为的金属钌配合物中的一种。优选的，所述实时荧光定量PCR的延伸阶段利用一定的荧光通道采集信号，荧光通道的荧光激发波长和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，根据该信号获得所述标准品或未知拷贝数的核酸样品的循环阈值。优选的，若核酸样品为RNA，则扩增前将提取的RNA反转录为DNA。优选的，所述实时荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：1)设计引物根据检测目的及样品的不同选取靶序列并设计引物；2)配制反应体系将热稳定DNA聚合酶、引物、dNTP、反应缓冲液、模板DNA以及上述金属钌配合物等加入PCR反应管中，加水补齐至终体积；3)实时荧光定量PCR根据靶序列及引物的不同，确定扩增程序；以已知初始浓度的DNA样品为模板，对模板进行预变性后按扩增程序循环反应并在循环反应的延伸步骤进行信号收集，荧光信号的收集通道为：激发波长400-500nm，发射波长550-750nm；循环反应结束后再次进行延伸；然后根据收集的信号建立扩增曲线，由扩增曲线确定该DNA样品的循环阈值；4)重复步骤3)，得到不同初始浓度的DNA样品各自的循环阈值，结合对应DNA样品的浓度建立标准曲线；5)按照步骤3)对未知初始浓度的DNA样品进行扩增，获得相应的循环阈值并带入步骤4)获得的标准曲线中，从而计算得到该DNA样品的初始浓度。优选的，所述扩增程序为：对经过预变性的模板加热变性，然后使引物与热变性得到的单链模板复性，然后在DNA聚合酶的作用下延伸。优选的，所述未知初始浓度的DNA样品利用试剂盒法提取并纯化得到。本专利技术的另一个目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述金属钌配合物、热稳定DNA聚合酶、4种核苷酸(dNTP)以及金属离子混合物。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术通过将金属钌配合物与实时荧光定量PCR技术相结合，利用金属钌配合物作为荧光染料与核酸(例如，dsDNA)结合时荧光强度大幅度上升的特点，实现对核酸进行实时扩增并定量检测。本专利技术采用作为核酸分子光开关的金属钌配合物为荧光染料，具有容易合成、结构稳定、水溶性好等优点，广泛适用于各类样品的核酸定量中。因此可以代替现有商品化有机染料，并作为一种应用于实时荧光定量PCR检测的新型、有开发前景的DNA结合染料，对研发核酸检测试剂具有重要意义。附图说明图1A为金属钌配合物在95℃孵育时荧光信号的稳定性；其中Ru-bpy代表[Ru(bpy)2(dppz)]2+，Ru-phen代表[Ru(phen)2(dppz)]2+。图1B为[Ru(bpy)2(dppz)]2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分；以拷贝数不同的多个核酸样品作为标准品，将各标准品分别作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序分别进行实时荧光定量PCR，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线；以未知拷贝数的核酸样品作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序进行实时荧光定量PCR，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的DNA拷贝数。

【技术特征摘要】
1.一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分；以拷贝数不同的多个核酸样品作为标准品，将各标准品分别作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序分别进行实时荧光定量PCR，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线；以未知拷贝数的核酸样品作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序进行实时荧光定量PCR，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的DNA拷贝数。2.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述金属钌配合物选自钌多吡啶配合物或配体经过结构修饰的、具有核酸分子光开关行为的金属钌配合物中的一种。3.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的延伸阶段利用一定的通道收集荧光信号，通道的激发波长和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，根据该信号获得所述标准品或未知拷贝数的核酸样品的循环阈值。4.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述核酸样品为DNA或由提取的RNA反转录而成的DNA。5.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：1)设计引物根据检测目的及样品的不同选取靶序列并设计引物；2)配制反应体系，反应体系包括热稳定DNA聚合酶、引物、dNTP、模板DNA以及所述金属钌配合物；3)实时荧光定量PCR根据靶序列及引物的不同...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秦峰，董菁，宋宏新，刘建兰，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61