绿盲蝽decapentaplegic基因及其RNAi在害虫防控中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种绿盲蝽decapentaplegic基因及其RNAi害虫防控应用，属于害虫防治领域。本发明专利技术首次从绿盲蝽中克隆得到decapentaplegic基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，以该基因作为RNAi的靶标，设计与合成绿盲蝽decapentaplegic基因不同靶标区域的dsRNA，通过注射、饲喂绿盲蝽decapentaplegic基因的dsRNA，统计注射后7日、连续饲喂7日每日的死亡率，结果显示，注射和饲喂dsRNA的绿盲蝽第7日死亡率达到90％以上，是非常高效的RNAi靶标基因。

Application of decapentaplegic gene and RNAi in pest control

The invention discloses a decapentaplegic gene of green bug and its RNAi pest control application, which belongs to the field of pest control. The decapentaplegic gene was cloned from green bug for the first time. The sequence of the decapentaplegic gene was shown as SEQ ID NO:1. Using the decapentaplegic gene as the target of RNAi, the dsRNA of different target regions of the decapentaplegic gene of green bug was designed and synthesized. The decapentaplegic gene of green bug was injected and fed with the RNA of the decapentaplegic gene, and the DNA of the decapentaplegic gene was counted 7 days after injection and even after injection. The results showed that the mortality rate of green bugs injected with and fed with dsRNA reached more than 90% on the 7th day, which was a highly efficient target gene of RNAi.

【技术实现步骤摘要】
绿盲蝽decapentaplegic基因及其RNAi在害虫防控中的应用
本专利技术属于昆虫分子生物学与生理学领域，具体涉及绿盲蝽decapentaplegic基因的cDNA的克隆，绿盲蝽decapentaplegic基因双链RNA(dsRNA)的设计，合成与及其通过RNAi途径防治害虫绿盲蝽的应用。
技术介绍
绿盲蝽(Lyguslucorum)，隶属于半翅目，盲蝽科，又称花叶虫，小臭虫。除青海西藏等少数地方，几乎遍布我国所有省份，是我国黄河流域长江流域为害棉花的多种绿盲蝽的优势种，几遍全国各棉区。绿盲蝽为杂食性害虫，寄主范围十分广泛，寄主包括棉花、十字花科蔬菜、豆类、玉米、瓜类、花卉、马铃薯、以及各种果树等，给我国农业和林业造成了巨大损失。2000年以前，绿盲蝽并非是我国棉产区农业生产的主要害虫，其种群数量低，基本不需专门防治。在防治棉花主要害虫绿盲蝽的同时即可将绿盲蝽杀死。近几年来，由于蔬菜、果树以及其他寄主作物种植面积的大幅度增加，给绿盲蝽提供了适宜的越冬场所和多样的寄主，规模化种植转基因Bt棉花有效的减少以绿盲蝽为主的鳞翅目害虫的危害，减少了农药的使用。另外，多种高毒农药的停用，致使绿盲蝽的种群数量迅速上升，并呈灾变的趋势。在很多地区已经成为了农业生产的重要害虫。目前对绿盲蝽的防治主要依靠化学防治，该方法不仅容易导致其产生抗药性，而且对环境造成污染。因此，发展一种经济有效、环境友好的方法控制绿盲蝽具有重要意义。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。基于RNAi技术可以研发RNAi杀虫剂和RNAi转基因作物。RNA杀虫剂就是利用RNA干扰技术暂时性关闭病虫发育过程中的关键基因，阻碍其正常的生长和繁殖，从而达到抑制病原物致病力，阻止害虫生长发育的目的。该技术最大特点是目标害虫专一性强，不会伤害包括天敌在内的任何其他生物，没有改变病虫的基因组，不会对生态系统产生影响；其主要成份是双链RNA，在生物中均普遍存在的化合物，在自然环境中极易降解，因此RNA杀虫剂无毒、无残留，是一种绝对绿色环保、有应用前景的杀虫剂。RNAi转基因作物是将靶标基因的RNAi成分导入作物，害虫在取食作物的时候关键基因会被关闭，从而降低虫口密度达到害虫防控的目的。2016年以来，加拿大食品检疫局和美国国家环境保护局相应批准了一个以Snf7基因为靶标，通过RNAi技术防治鞘翅目昆虫玉米根萤叶甲(WCR)转基因玉米的商业化，预计2020年RNAi杀虫制剂市场也将被开放。以RNAi为基础的害虫防治是最前沿的害虫防控技术，但除鞘翅目昆虫以外，其他昆虫的高效杀虫靶标基因并不多，因此，寻找合适的杀虫靶标是一项非常紧迫的工作。decapentaplegic可以控制昆虫四肢、翅等多种器官的发育，是参与果蝇及其他多种昆虫发育的关键形态发生素，采用因此decapentaplegic是非常有应用价值的RNAi靶标基因。但现有技术中还没有以decapentaplegic为靶标的RNAi防治技术。
技术实现思路
本专利技术提供一种绿盲蝽decapentaplegic基因及其在RNAi上的应用，通过注射、饲喂绿盲蝽decapentaplegic基因的dsRNA，统计注射后7日、连续饲喂7日，测定每日的死亡率，结果显示，注射和饲喂dsRNA的绿盲蝽第7日死亡率达到90％以上，是非常高效的RNAi靶标基因。一种绿盲蝽decapentaplegic基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种dsRNA，以上述绿盲蝽decapentaplegic基因全序列或部分序列为靶标合成得到。所述靶标为绿盲蝽decapentaplegic基因第791-1148位片段。所述dsRNA，其序列如SEQIDNO.2所示。绿盲蝽decapentaplegic基因在害虫防控中的应用。所述应用为以绿盲蝽decapentaplegic基因全序列或部分序列为靶标设计的dsRNA，将其导入害虫体内，使其致死。所述靶标为绿盲蝽decapentaplegic基因第791-1148位片段。所述dsRNA序列如SEQIDNO.2所示。所述dsRNA制备成喷洒式杀虫剂，喷洒渗入害虫体内使绿盲蝽致死；或者将dsRNA转入绿盲蝽寄主植物体内，绿盲蝽摄食植物而致死；或者dsRNA制备成饵剂，绿盲蝽摄食而致死。一种生物制品，含有上述的dsRNA。所述的生物制品，为喷洒式杀虫剂或饵剂。本专利技术的技术方案通过下述方法实现：以上述基因为靶标使用RNAi的方法防控害虫，主要包括以下步骤：(1)从绿盲蝽幼虫提取总RNA，反转录合成cDNA，以此cDNA为模板通过decapentaplegic基因的特异性引物进行PCR扩增，得到扩增片段，纯化PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pGME-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，筛选含目的片段的阳性克隆，将阳性克隆进行序列测定，获得decapentaplegic基因全长序列；Primer-F：TAATACGACTCACTATAGGGACGGTAAGAACAAGGTTAGAPrimer-R：TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGACTTTGCTTTCATC(2)选取decapentaplegic基因中任意长度片段作为靶标合成dsRNA。(3)通过显微注射(机械损伤、体表渗入)及饲喂(取食)的方法将dsRNA传递至绿盲蝽体内发挥RNAi功效。本专利技术人首次从绿盲蝽中克隆得到的decapentaplegic基因，其序列如SEQIDNO：1所示，该基因能够作为RNAi的靶标，在绿盲蝽的防治中具有极高的应用价值。以上述的decapentaplegic基因中选取第791-1148位为例，作为干涉靶标合成dsRNA(见SEQIDNO.2)。通过注射、饲喂绿盲蝽decapentaplegic基因的dsRNA，统计注射后7日、连续饲喂7日每日的死亡率，以绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组进行相同处理。结果显示，注射和饲喂dsRNA的绿盲蝽第7日死亡率达到90％以上。本专利技术为通过RNAi手段开发RNAi制剂和转基因RNAi植物提供了极高效的靶标基因。不仅限于绿盲蝽，其他物种的decapentaplegic基因也可以作为RNAi靶标基因被应用。附图说明图1为注射decapentaplegic基因dsRNA后7日内绿盲蝽的存活率。以GFP(绿色荧光蛋白)dsRNA为对照。图2为连续饲喂decapentaplegic基因dsRNA7日每日绿盲蝽的存活率。以GFP(绿色荧光蛋白)dsRNA为对照。具体实施方式下面通过具体实施例进一步说明本专利技术。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。实施例1：decapentaplegic基因克隆、decapentaplegic基因dsRNA的制备，显微注射法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绿盲蝽decapentaplegic基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种绿盲蝽decapentaplegic基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种dsRNA，以权利要求1所述的绿盲蝽decapentaplegic基因全序列或部分序列为靶标合成得到。3.根据权利要求2所述的dsRNA，所述靶标为绿盲蝽decapentaplegic基因第791-1148位片段。4.根据权利要求3所述的dsRNA，其序列如SEQIDNO.2所示。5.权利要求1所述的绿盲蝽decapentaplegic基因在害虫防控中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，为以权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王桂荣，杨斌，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11