本发明专利技术公开了一种高亲和力的PD‑1膜外区突变体，所述PD‑1膜外区突变体包含选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5的氨基酸序列。本发明专利技术进一步提供了所述高亲和力的PD‑1膜外区突变体的融合蛋白及其应用。本发明专利技术创造性的合成了高亲和力的PD‑1膜外区突变体或其融合蛋白，所述融合蛋白与野生型PD‑1相比具有更高的结合人PD‑L1或PD‑L2的亲和力、更大的效力。本发明专利技术的融合蛋白为肿瘤的免疫治疗提供了更加广阔的途径。
A high affinity fusion protein of PD-1 outer membrane region mutant and its pharmaceutical composition and use
The invention discloses a high affinity PD 1 outer membrane mutant, which comprises amino acid sequences selected from SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO.5. The invention further provides the fusion protein of the high affinity PD_1 outer membrane mutant and its application. The invention creatively synthesizes a high affinity PD_ 1 outer membrane mutant or its fusion protein, which has higher affinity and greater efficacy for binding human PD_ L1 or PD_ L2 than wild type PD_ 1. The fusion protein of the invention provides a wider way for tumor immunotherapy.
【技术实现步骤摘要】
一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白及其药物组合物和用途
本专利技术涉及肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白及其药物组合物和用途。
技术介绍
肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的，肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中热点之一，临床试验中也取得了显著的治疗效果。PD-1及其配体PD-L1/L2介导了对T细胞的抑制“耗竭”以及诱导免疫耐受的作用，肿瘤细胞表面高表达的PD-L1/L2与PD-1相互作用导致肿瘤细胞的免疫逃逸，因此抑制PD1～PD-L1/L2信号通路，重新激活被抑制的免疫系统成为最近免疫治疗的热点。程序性死亡受体1(PD-1，也称PDCD1和CD279)，由日本京都大学本庶佑(HonjoTasuku)教授于1992年发现。PD-1分为胞外区、跨膜区和胞质区三个部分，含有288个氨基酸的蛋白，分子量约为50～55kD。胞外区含一个IgV样结构域，是与PD-1的配体结合并进而诱导免疫应答功能的区域，该区域含有4个N糖基化位点；胞质区含有1个ITIM(Immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif，也即免疫受体酪氨酸抑制基序)，和1个ITSM(Immunoreceptortyrosine-basedswitchmotif，也即免疫受体酪氨酸转化基序)，其中，ITSM的激活与效应性T细胞免疫应答密切相关。PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞及髓系细胞上，主要在维持T细胞耗竭中发挥重要作用，具有抑制T细胞的效应功能,因而慢性病原体和肿瘤细胞利用PD-1通路逃避免疫应答。PD-L1蛋白：华裔科学家陈列平教授于1999年发现B7-H1，该蛋白随后在2000年被证实能够特异性结合PD-1，并命名为PD-L1，即程序性死亡分子配体-1(programmeddeathligand1,也称CD274和B7-H1)；PD-L1分为胞外区、跨膜区疏水区和胞质区三个部分，由290个氨基酸亚基组成；其中胞外区包含两个免疫球蛋白恒定区IgC和IgV样结构域，胞质区是由30个氨基酸组成。PD-L1主要表达于成熟的CD4+、CD8+T细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞；同时PD-L1常常高表达于多种肿瘤细胞表面，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌等，同时，肿瘤细胞PD-L1的高表达与肿瘤患者较差的预后、肿瘤的复发有关，并且与肿瘤大小、淋巴结受累、分级、总生存期也相关。PD-L2蛋白：PD-1的另一个配体PD-L2即程序性死亡分子配体-2(programmeddeathligand2,也称CD273和B7-DC)是2001年被发现，PD-L2由274个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，PD-L2与PD-L1有很高的相似性，PD-L2与PD-1相互作用能够抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和T细胞溶解作用，但PD-L2与PD-1的亲和力是PD-L1的2～6倍。PD-L2在巨噬细胞、树突状细胞和一些B细胞亚类的膜表面表达，同时多种方法检测到PD-L2在肿瘤细胞中的表达，而其中一些样本中并未检测到PD-L1的表达。因此能够同时高效阻断PD-1～PD-L1以及PD-1～PD-L2的药物有待进一步开放。2005年，日本小野制药和美国Medarex制药共同合作开发PD-1抗体药物Nivolumab，并于2009年被百时美施贵宝收入囊中。2009年默沙东收购先灵葆雅，获得PD-1抗体药物Pembrolizumab的后续开发权。2014年，百时美施贵宝的Nivolumab和默沙东的Pembrolizumab相继获得上市批准。2016年，基因泰克的PD-L1抗体Atezolizumab获得FDA批准上市；2017年辉瑞与默沙东的PD-1抗体药物Bavencio和阿斯利康的PD-1抗体药物Imfinzi相继上市。多家大公司将这个肿瘤免疫治疗药物视为未来几年立足肿瘤免疫治疗领域的重磅产品。尽管目前已有多个PD-1和PD-L1抗体的药物上市，但基于PD-1的融合蛋白的药物鲜有报道；而且能够同时高效阻断PD-1～PD-L1以及PD-1～PD-L2的药物也亟待开发，以更有效地阻断PD-l的信号通路。肿瘤细胞表面高表达的PD-L1/L2与PD-1相互作用导致肿瘤细胞的免疫逃逸，用PD-1或PD-L1的抗体阻断该通路可激活免疫系统，进而杀伤肿瘤细胞。而由于相关PD-L1/L2和PD-1在免疫细胞上同样也有表达，考虑到PD-1/PD-L1抗体如果具有太强的ADCC、CDC、ADCP等活性会杀伤自体的免疫细胞，因而PD-1/PD-L1抗体大多设计为阻断性的抗体，而不具有ADCC、CDC等作用。如百时美施贵宝的Nivolumab和默沙东的Pembrolizumab等PD-1抗体均采用弱ADCC活性的IgG4亚型；基因泰克的PD-L1抗体Atezolizumab采用去掉糖基化位点IgG1亚型，基本不具有ADCC活性；阿斯利康的Imfinzi则通过突变了IgG1的三个氨基酸(L234F,L235E,P331S)去除ADCC活性。而辉瑞/默克的Avelumab却采用了具有ADCC、CDC等活性的IgG1亚型，因PD-L1在肿瘤细胞显著高表达上，强ADCC活性的PD-L1抗体也有其优势，那就是解除癌细胞免疫逃逸的同时，也可以结合ADCC作用介导NK细胞杀伤癌细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高亲和力的PD-1膜外区突变体、以及包含该高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白。本专利技术的目的还在于提供包含上述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或其融合蛋白药的物组合物及其用途。为实现上述目的，本专利技术首先提供一种高亲和力的PD-1膜外区突变体，所述PD-1膜外区突变体包含选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5的氨基酸序列。在一实施例中PD-1膜外区突变体是M2C5，其具有SEQIDNO.2的氨基酸序列；在一实施例中PD-1膜外区突变体是M3H6，其具有SEQIDNO.3的氨基酸序列；在一实施例中PD-1膜外区突变体是M4B3，其具有SEQIDNO.4的氨基酸序列；在一实施例中PD-1膜外区突变体是M5G8，其具有SEQIDNO.5的氨基酸序列。进一步地，本专利技术还提供了一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白，所述融合蛋白包括选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5的氨基酸序列的蛋白，可选的，还可以包括具有其他功能的蛋白。优选地，所述融合蛋白与PD-L1的亲和力与野生型PD-1相比提高至少50倍；在一实施例中，本专利技术的融合蛋白与PD-L1的亲和力与野生型PD-1相比提高1000倍以上；所述融合蛋白与PD-L2的亲和力与野生型PD-1相比提高至少10倍；在一实施例中，本专利技术的融合蛋白与PD-L2的亲和力与野生型PD-1相比提高300倍以上。优选地，所述融合蛋白还包括Fc片段，所述Fc片段选自人IgG1或IgG4的Fc及其突变型，其中人IgG1Fc的N298A突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，其中人IgG4Fc的S228P突变体的氨基酸序列如S本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高亲和力的PD‑1膜外区突变体，所述PD‑1膜外区突变体包含选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种高亲和力的PD-1膜外区突变体，所述PD-1膜外区突变体包含选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5的氨基酸序列。2.一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白，所述融合蛋白包括选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5的氨基酸序列的蛋白，可选的，还可以包括具有其他功能的蛋白；所述融合蛋白与PD-L1的亲和力与野生型PD-1相比提高至少50倍；所述融合蛋白与PD-L2的亲和力与野生型PD-1相比提高至少10倍。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括Fc片段，所述Fc片段选自人IgG1或IgG4的Fc及其突变型，其中人IgG1Fc的N298A突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，其中人IgG4Fc的S228P突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。4.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括6×His，所述6×His的氨基酸序列如SEQIDNO.20。5.如权利要求3或4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括Linker，所述PD-1膜外区突变体通过Linker与Fc片段、6...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵健，魏化伟，黄亚杰，
申请(专利权)人：江苏东抗生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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