一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法技术

本发明专利技术公开了人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。它包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D‑RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片；酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。本发明专利技术方法制备的人RPE细胞的特性与人胚胎来源RPE细胞特性极其类似，具有典型RPE细胞形态特征，并呈现正常生理功能。本发明专利技术方法制备的人RPE细胞可传代培养，大量扩增，为视网膜疾病的研究和治疗提供种子细胞，造福失明患者，解决了现有人视网膜色素上皮细胞来源有限，RPE移植供体缺乏的重要缺陷，具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法
：本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。
技术介绍
：视网膜色素上皮(RPE,retinalpigmentepithelium)位于视网膜神经上皮层外侧，为后者提供营养并参与光转导反应。其变性死亡或功能异常是视网膜变性眼病的重要原因。视网膜色素上皮细胞移植是最有前景的复明手段之一，但RPE细胞缺乏制约了该治疗措施的开展。干细胞技术兴起之前，RPE细胞来源局限于从早期流产胚胎或自愿者捐赠的眼球分离获得。最近研究表明，人多能干细胞(humanpluripotentstemcell,hPSC)，包括人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell,hESC)和人诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcell,hiPSC)，具有向视网膜色素上皮细胞分化的能力。hPSCs诱导来源的RPE细胞是治疗视网膜变性疾病最有发展前景的种子细胞。多能干细胞分化为RPE细胞的诱导方法大体分为两类，2D传统贴壁培养法和3D视网膜诱导分化法。然而，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D‑RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片，酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D-RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片，酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的3D-RPE球体是将人多能干细胞定向诱导分化为包括RPE细胞的视网膜细胞，随后将贴壁细胞包括RPE细胞刮起，进行悬浮培养，获得3D-RPE球体，3D-RPE球体是游离的，粘附于神经视网膜杯的一侧或粘附于其他细胞团的一侧。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片具体为：将所有3D-RPE球体转移到细胞容器内，用消化液于37℃水浴下消化8-15min，吸除消化液，1×PBS洗若干次后，使用钨丝针将含有色素的RPE细胞片与无色素的非RPE细胞或团块分离，留取含有色素的RPE细胞片。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，其步骤具体为：将含有色素的RPE细胞片，用TrypLEExpress溶液，37℃水浴消化7-10min，终止消化，70-100μm滤网过滤细胞，离心去消化液，用RPE细胞培养基重悬，获得RPE单细胞悬液。5.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的扩增培养方法，其特征在于，将权利要求1的RPE单细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟秀风，葛坚，刘胜旭，彭福华，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东,44