一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法技术

本发明专利技术公开了人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。它包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D‑RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片；酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。本发明专利技术方法制备的人RPE细胞的特性与人胚胎来源RPE细胞特性极其类似，具有典型RPE细胞形态特征，并呈现正常生理功能。本发明专利技术方法制备的人RPE细胞可传代培养，大量扩增，为视网膜疾病的研究和治疗提供种子细胞，造福失明患者，解决了现有人视网膜色素上皮细胞来源有限，RPE移植供体缺乏的重要缺陷，具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法
：本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。
技术介绍
：视网膜色素上皮(RPE,retinalpigmentepithelium)位于视网膜神经上皮层外侧，为后者提供营养并参与光转导反应。其变性死亡或功能异常是视网膜变性眼病的重要原因。视网膜色素上皮细胞移植是最有前景的复明手段之一，但RPE细胞缺乏制约了该治疗措施的开展。干细胞技术兴起之前，RPE细胞来源局限于从早期流产胚胎或自愿者捐赠的眼球分离获得。最近研究表明，人多能干细胞(humanpluripotentstemcell,hPSC)，包括人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell,hESC)和人诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcell,hiPSC)，具有向视网膜色素上皮细胞分化的能力。hPSCs诱导来源的RPE细胞是治疗视网膜变性疾病最有发展前景的种子细胞。多能干细胞分化为RPE细胞的诱导方法大体分为两类，2D传统贴壁培养法和3D视网膜诱导分化法。然而，这些方法获得的RPE通常与hPSC分化过程中产生的非RPE细胞混杂在一起。因此，如何将其中的RPE细胞分离纯化，获取RPE种子细胞，供相关研究或治疗使用，是目前需要解决的技术难题。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种简单、适用范围广的人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。本专利技术的一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D-RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片，酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。本专利技术方法制备的多能干细胞来源RPE细胞的特性与人胚胎来源RPE细胞特性极其类似，具有典型RPE细胞形态特征，表达特异分子标签PAX6，OTX2，ZO-1和RPE65，并呈现正常生理功能如极性分泌细胞因子PEDF。所述的人多能干细胞优选为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。这两种细胞用公知的方法进行细胞培养。所述的3D-RPE球体是人多能干细胞定向诱导分化为含有RPE细胞的视网膜细胞，随后将贴壁细胞包括RPE细胞刮起，进行悬浮培养，获得3D-RPE球体。3D-RPE球体可以是游离的，也可以粘附于神经视网膜杯的一侧，或粘附于其他细胞团的一侧。所述的3D-RPE球体优选为人多能干细胞诱导分化40天以上的3D-RPE球体。hPSC启动分化(即hPSC的扩增培养液更换为分化培养液或制备拟胚体)的当天设置为分化的第“0”天。所述的机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片具体为：将所有3D-RPE球体转移到细胞容器内，用消化液于37℃水浴下消化8-15min，吸除消化液，1×PBS洗若干次后，使用钨丝针将含有色素的RPE细胞片与无色素的非RPE细胞或团块分离，留取含有色素的RPE细胞片。所述的消化液优选为质量分数1-2％的DispaseII溶液。所述的酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，其步骤具体为：将含有色素的RPE细胞片，转移到TrypLEExpress溶液中，37℃水浴下消化7-10min，离心去消化液，用RPE细胞培养基重悬，70-100μm滤网过滤细胞，获得RPE单细胞悬液。本专利技术还提供了一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的扩增培养方法，其特征在于，将上述RPE单细胞悬液离心后弃上清再用RPE细胞培养基重悬，接种到预先包被了细胞外基质的细胞培养容器中进行原代培养，细胞长满后进行传代培养，获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。优选，所述的原代培养接种的细胞密度大于等于5×104个细胞/cm2。所述的细胞长满后进行传代培养具体为：当原代培养的细胞融合度达到90-100％时，弃培养基，PBS洗涤，用TrypLEExpress，37℃培养箱内消化7-10min，用RPE细胞培养基终止消化，用移液枪轻轻吹下细胞，离心去除消化液，用RPE细胞培养基重悬细胞，接种细胞到预先包被了细胞外基质的细胞培养容器内，进行传代培养；当细胞融合度达到90-100％时，重复上述步骤进行反复传代培养；所述的传代培养接种的细胞密度大于等于2×104个细胞/cm2。本专利技术的方法获得的人RPE细胞至少可以传5代以上。所述的细胞外基质优选为Matrigel或Gelatin。所述的细胞培养容器优选为培养板、培养皿或培养瓶。所述的原代培养和传代培养的细胞培养基的配方均为：每100mL细胞培养基含有10mL胎牛血清、2mL50×B27、1mL100×青链霉素混合液、1mL100×非必需氨基酸、1mL100×谷氨酰胺和0.1mL1000×牛磺酸，余量为DMEM/F12(3:1)混合培养基，所述的DMEM/F12(3:1)混合培养基是由DMEM/F12(1:1)培养基和DMEM培养基按照体积比为3:2混合而成。所述的人RPE细胞冻存，具体为：所获得的RPE原代细胞及传代细胞均可以用公知的方法进行冻存。冻存液为含有体积分数为10％DMSO的细胞培养基。冻存后的RPE细胞可以复苏并具有同样细胞特性。本专利技术方法制备的多能干细胞来源人RPE细胞特性与人胚胎来源RPE细胞特性极其类似，具有典型RPE细胞形态特征，表达特异分子标签PAX6，OTX2，ZO-1和RPE65，并呈现正常生理功能如极性分泌细胞因子PEDF，因此，可为相关研究与治疗提供种子细胞材料。本专利技术的方法与现有技术相比，具有以下优点：1.适用范围广，适用于从hPSC制备、纯化、扩增人RPE细胞，包括从人多能干细胞系(hESC和hiPSC)经2D或3D诱导分化条件获得的RPE细胞。2.技术简便，主要通过机械分离和酶消化来分离、纯化、扩增RPE细胞，不依赖流式细胞仪、磁珠分选或报告基因标记技术等复杂实验设备和技术。消化RPE所用的消化液DispaseII和TrypLEExpress也比较温和，对RPE细胞的损害轻微。采用本专利技术方法，已成功完成三种不同hPSC系来源的RPE细胞的制备，每个细胞系重复了至少3次以上的实验。整套实验技术简便易学，初学者也可快速掌握，成本低，效益好。3.用本专利技术方法获得的hPSC来源人RPE细胞具有良好的扩增、传代能力，生长特性良好，产量高，可以批量获取，减少批次间的差异。以大于2×104个细胞/cm2的密度接种于Matrigel包被的培养板时，细胞生长7天左右可有90％以上融合度。本专利技术方法制备的RPE细胞经过扩增培养，可获得接近15倍扩增效率，连续传3代可扩增超过3000倍。本专利技术方法获得的RPE细胞倍增天数约1.52天，完成扩增1代仅需7天，至少可以传代5次以上，并且具有冻存复苏能力。4.本专利技术方法制备的hPSC来源人RPE细胞可获得典型RPE细胞形态并色素化，与人胚胎来源RPE细胞的培养特性和细胞形态类似。5.本专利技术方法制备的RPE细胞表达RPE特异分子标签PAX6，OTX2，ZO-1，RPE65，与人胚胎视网膜来源RPE细胞特性类似。6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D‑RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片，酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D-RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片，酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的3D-RPE球体是将人多能干细胞定向诱导分化为包括RPE细胞的视网膜细胞，随后将贴壁细胞包括RPE细胞刮起，进行悬浮培养，获得3D-RPE球体，3D-RPE球体是游离的，粘附于神经视网膜杯的一侧或粘附于其他细胞团的一侧。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片具体为：将所有3D-RPE球体转移到细胞容器内，用消化液于37℃水浴下消化8-15min，吸除消化液，1×PBS洗若干次后，使用钨丝针将含有色素的RPE细胞片与无色素的非RPE细胞或团块分离，留取含有色素的RPE细胞片。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，其步骤具体为：将含有色素的RPE细胞片，用TrypLEExpress溶液，37℃水浴消化7-10min，终止消化，70-100μm滤网过滤细胞，离心去消化液，用RPE细胞培养基重悬，获得RPE单细胞悬液。5.一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的扩增培养方法，其特征在于，将权利要求1的RPE单细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟秀风，葛坚，刘胜旭，彭福华，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东,44