一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗技术

本发明专利技术公开了一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗，病毒接种所用细胞系为EB66细胞系（一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株），病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养；并经过1）毒种选育；2）建立毒种种子批；3）制备细胞毒液；4）灭活病毒；5）乳化等步骤完成疫苗的制备。本发明专利技术方法具有制备的细胞毒液病毒含量高、生产工艺稳定、智能化控制、可大规模无血清悬浮培养、易操作和成本低等特点，制备的鸭坦布苏病毒灭活疫苗具有安全、副反应低、免疫效力高、批间差异小、检验次数少和成本低等优点，为水禽产业预防鸭坦布苏病毒病发生和流行的理想疫苗。

Method for preparing duck tembus virus disease inactivated vaccine and vaccine thereof

The invention discloses a method for preparing an inactivated vaccine for duck Tambusu virus disease and its vaccine. The cell line used for virus inoculation is EB66 cell line (a duck embryonic stem cell derived cell line), the virus culture is carried out in a bioreactor in a serum-free full suspension mode, and the virus seeds are established through 1) virus breeding; Batch (3) preparation of cell venom; 4) inactivation of the virus; 5) emulsification and other steps to complete the preparation of the vaccine. The method of the invention has the characteristics of high content of cytotoxic virus, stable production process, intelligent control, large-scale serum-free suspension culture, easy operation and low cost. The prepared inactivated duck tambusu virus vaccine has the advantages of safety, low side effects, high immune efficacy, small difference between batches, less test times and cost. It is an ideal vaccine for waterfowl industry to prevent the occurrence and epidemic of duck Tempe virus disease.

【技术实现步骤摘要】
一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗
本专利技术涉及一种疫苗的制备方法，更具体地说涉及用一种细胞系生产鸭坦布苏病毒病灭活苗的方法，属于生物
技术背景我国鸭存栏量每年约40亿只。从2010年春季开始，我国浙江、江苏、山东、河北和北京等地区相继暴发了一种以鸭产蛋下降为主要特征的疫病，雏鸭发病后期出现精神沉郁、体重减轻、仰翻、侧翻和死亡等临床症状，若细菌继发感染，出现肝周炎、心包炎和气囊炎等，死淘率增加。2010年，根据产蛋下降和卵泡出血，将该病命名鸭出血性卵巢炎（duckhemorrhagicovaritis,DHO），后经病原学研究证实该病是由黄病毒科坦布苏病毒（DuckTembusuVirus,DTMUV）引起，将该病命名为鸭坦布苏病毒病。北京鸭、樱桃谷鸭、金定鸭、麻鸭和康贝尔鸭等均可发病，该病给养鸭业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是预防传染病有效和经济的方法之一，疫苗制备方法与疫苗的质量和成本密切相关，能够生成出抗原含量高、批间差异小、低成本和易放大等工艺是研究的重点，是行业发展方向。在疫苗研究方面，研究人员就全病毒灭活疫苗和致弱活疫苗进行了大量的研究工作，鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）和活疫苗（WF100）先后获得新兽药注册证书。目前资料表明，研究人员或疫苗生产企业主要利用鸭胚、鸡胚、鸡胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞、BHK－21、Vero细胞、DF-1细胞等细胞增殖病毒。我们的研究结果表明，利用无血清全悬浮BHK-21细胞反应器培养的鸭坦布苏病毒含量低，利用微载体灌流法悬浮培养Vero细胞培养的病毒液，其病毒含量可达到制备疫苗的标准，但是由于微载体和血清昂贵，存在成本高和不易放大的缺点，不适合养鸭企业适用。采用无血清全悬浮何种细胞培养病毒含量高、培养成本低的鸭坦布苏病毒培养工艺，是我们多年来一直研究和摸索的工作。EB66细胞来源于鸭胚干细胞，经驯化后形成的一种遗传稳定、纯净、可在无血清培养基中大规模悬浮培养、广泛用于人或动物疫苗生产用细胞系。国内外尚未见建有利用鸭胚干细胞EB66和无血清全悬浮反应器培养鸭坦布苏病毒的报道或专利申请。
技术实现思路
为克服利用鸭胚生产存在的劳动强度大、成本高、工艺复杂、自动化程度低、抗原批间差异大和现有细胞培养的病毒含量低等缺点，提供一种用鸭胚干细胞系EB66生产鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种制备鸭坦布苏病毒病出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，所述细胞系为EB66（一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株），病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养。上述方法，包括如下步骤：1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在EB66细胞系中连续传代至病毒适应细胞，经鸡胚有限稀释克隆法，取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养，培养出病毒含量高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株（基础种毒株）；2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种EB66细胞，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代，处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥106.5ELD50/1ml。以1～10ml/冻存管的剂量分装，-70℃保存。确定无菌检验、特异性检验、病毒含量检验和外源病毒检验合格的F2～F7代作为毒种种子批，其中F2～F5代病毒为基础毒种，F6～F7代为生成种毒（工作种子）；确定病毒感染复数（MOI）：测定F6和F7代生成种毒的病毒含量（ELD50，鸡胚半数感染量），通过1个ELD50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥107.1ELD50/1ml的标准，确定了F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001；3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞，培养条件为温度30～37℃，pH7.2～7.5；当反应器中利用无血清培养基全悬浮培养的EB66细胞数量达到400～1000万时，接种F6或F7代毒种，作用2h后，加入2倍细胞体积维持液，30～37℃继续培养，30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量应≥107.1ELD50/1ml；4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液总量（V/V）0.1～0.2%的灭活剂，2～37℃振荡灭活16～144h；成品检验：取所得灭活病毒，以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡，判定毒液灭活完全；同时，取样，接种细菌检验用TG、GA和GP培养基，观察10日，无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染；5）乳化：向步骤4）所得细胞毒液加入（V/V）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3：1进行乳化，乳化后即得成品。上述方法，所述细胞为鸭胚干细胞系（EB66）；上述方法：所述培养方法为细胞培养三角摇瓶或生物反应器，全悬浮细胞培养工艺；上述方法：所述培养基为无血清培养基；上述方法：毒株选育技术为鸡胚有限稀释法纯化技术；上述方法，所述病毒感染复数（MOI）为0.1～0.001；上述方法，所述培养工艺为接种病毒后，作用2h，再加入2倍体积的细胞维持液，30～37℃继续培养30～120h；上述方法，细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理；上述方法，所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液，2～37℃振荡灭活16～144h；上述方法，所述灭活检验方法为以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡；上述方法，所述乳化成疫苗的方法为按照油相与水相的体积比1.5～3:1进行乳化，乳化后即得疫苗成品。与现有技术相比，本专利技术具有如下显著的有益效果：（1）鸭坦布苏病毒用本专利技术确定的鸭胚干细胞系EB66培养，病毒适应性好和病毒含量高；（2）经鸡胚有限稀释法筛选出的毒种免疫原性好；（3）用反应器培养鸭坦布苏病毒，显著降低了病毒的扩散风险，具有更好的安全性；（4）不采用鸭胚培养病毒工艺，不需要专门饲养种鸭和避免了挑选易感鸭胚的繁琐；（5）培养的病毒液中仅含有病毒和细胞碎片，与鸭胚增殖病毒方法相比，不需要无害化处理鸭胚组织物，对环境影响小；（6）利用鸭胚干细胞系EB66无血清全悬浮培养的病毒液，其病毒含量不低于鸭胚，显著高于（10～100倍）BHK-21细胞培养的病毒。由于不使用微载体，成本显著低于微载体灌流法Vero细胞培养工艺。（7）无血清全悬浮工艺培养的病毒液成本不到鸭胚工艺的一半。（8）由于不需要鸭胚孵化车间、逐枚接种、逐枚收获、组织到随机捣碎等优点，该方法占用空间小，制备流程简单。用鸭胚干细胞系EB66细胞生产的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，安全，副反应小，免疫效力更高，疫苗批间质量差异小。该生产工艺简单稳定、易操作、产量大、培养的半成品病毒含量高、成本低和外源病原污染几率小等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。具体实施方案实施例1一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，所述细胞系为鸭胚干细胞系EB66。上述方法，包括如下步骤：1）选育毒株：将鸭本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，病毒接种所用细胞系为EB66细胞系，病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养。

【技术特征摘要】
1.一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，病毒接种所用细胞系为EB66细胞系，病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养。2.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在EB66细胞系中连续传代至病毒适应细胞，经有限稀释克隆法，取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养并从中筛选出候选病毒株；2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种EB66细胞系，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代，处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥106.5ELD50/1ml；以F2～F7代作为毒种种子批，其中F2～F5代病毒为基础毒种保存，F6～F7代为生成毒种进行下一步工作；3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞，培养条件为温度30～37℃，pH7.2～7.5；当反应器中EB66细胞数量达到400～1000万时，接种步骤2）所得的F6或F7代毒种；作用2h后，加入细胞维持液，30～37℃继续培养；30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量≥107.1ELD50/1ml；4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液体积总量0.1～0.2%的灭活剂，2～37℃振荡灭活16～144h得...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘月焕，罗顺，林健，张业炘，杨志远，王嘉琪，王小蕾，杨云，段会娟，杨贵君，刘立新，耿风廷，程慧敏，陈佩兰，赵际成，赵志欣，潘洁，钱建宁，王盟，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，甘肃健顺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11