基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法技术

本发明专利技术涉及用于检测维氏气单胞菌的引物对，所述引物对的正向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1或由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列，所述引物对的反向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.2或由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列。本发明专利技术还涉及包含所述引物对或引物对组合的试剂、试剂盒及其在检测维氏气单胞菌中的应用。本发明专利技术还涉及开发用于检测维氏气单胞菌的引物的方法。

Primer, kit, detection method and development method of Aeromonas aeruginosa based on specific sequence of Vivtorinox

The present invention relates to a pair of primers for detection of Aeromonas verticillata. The nucleotide sequence of the forward primer pair is selected from SEQ ID NO.1 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1 is replaced, deleted and/or added by one or more nucleotides, and the nucleotide sequence of the reverse primer pair is generated. Sequences are selected from SEQ ID NO.2 or nucleotide sequences generated by substitution, deletion and/or addition of one or more nucleotides as shown in SEQ ID NO.2. The invention also relates to a reagent, a kit comprising the primer pair or the primer pair combination and its application in the detection of Aeromonas viridis. The invention also relates to a method for developing primers for detecting Aeromonas aeruginosa in Vivtorinox.

【技术实现步骤摘要】
基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法
本专利技术涉及一种基于特异性序列的维氏气单胞菌的检测引物、包含该引物的试剂、试剂盒、维氏气单胞菌的检测方法以及开发维氏气单胞菌的检测引物的方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)又被称为维罗纳气单胞菌、维隆气单胞菌、凡隆气单胞菌，是一种革兰氏阴性杆状细菌，属无芽孢兼性厌氧型。该菌散在分布，普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中，两端钝圆，大小约为0.3-0.7μm×1.2-2.5μm，具鞭毛，能运动(KirovSM,TassellBC,SemmlerAB,O'DonovanLA,RabaanAA等.“LateralflagellaandswarmingmotilityinAeromonasspecies”[J].JBacteriol.2002,184(2):547-555)。维氏气单胞菌属于强毒病原菌，致病过程主要包括黏附-侵袭-宿主体内定殖以及毒素分泌等过程，期间产生一系列毒力因子，如气溶素(aerolysin)、肠毒素(enterotoxin)和粘附因子(adherencefactor)等，这些毒力因子在水产动物、人类甚至畜禽感染中起着举足轻重的作用(袁旦一,汪开毓,陈德芳,黄凌远,王均等.“维氏气单胞菌在人工感染斑点叉尾鮰体内的组织定位和动态分布研究”[C].中国南方渔业论坛暨第二十九次学术会议论文集.广西北海,2013)。该菌侵染宿主范围十分广泛。首先，该菌是已知最古老的鱼类病原菌之一，感染多种淡水鱼类、海水鱼类等，给水产养殖鱼类以及野生鱼类带来了严重威胁(Bossi-KüpferM,GeniniA,PeduzziR,DemartaA.“TracheobronchitiscausedbyAeromonasveroniibiovarsobriaafternear-drowning”[J].JMedMicrobiol.2007,56(Pt11):1563-1564)。例如，草鱼感染维氏气单胞菌时局部出血、有腹水、脾脏肿大等症状(王浩,权可艳,徐丽娟,李梦影,吕利群.“恩诺沙星控制草鱼维氏气单胞菌的用药方案”[J].淡水渔业,2013,43(2):47-53)。同时，维氏气单胞菌还可以感染节肢动物和爬行类动物，如中华绒螯蟹(房海,陈翠珍,张晓君,巩元芳,葛幕湘.“中华绒螯蟹病原维氏气单胞菌的检验”[J].中国人兽共患病学报.2008,24(1):45-49)、中华鳖(钱明明.“中华鳖群体死亡症病原菌的分离鉴定及其预防的研究”[D].河北师范大学.硕士论文,2010)等。此外，该菌也能导致小鼠和正常人及免疫功能低下人群感染性并发症，引起包括关节炎、伤口感染、肠胃炎、菌血症、脑膜炎和心内膜炎等在内的多种感染病症(LyeDJ.“GastrointestinalcolonizationratesforhumanclinicalisolatesofAeromonasveroniiusingamousemodel”[J].CurrMicrobiol.2011,63(4):332-336)。近年来，日益增多的病例表明，维氏气单胞菌已成为一种重要的人-鱼共患致病菌，其分布广泛，致病性较强，并在食品安全方面占据举足轻重的地位，部分国家已经将其规定为食品安全的检疫对象(吴同垒,单晓枫,孟庆峰,郭伟生,王伟利,钱爱东等.“维氏气单胞菌研究进展”[J].中国兽药杂志,2011(07):41-44)。目前，维氏气单胞菌的鉴定和检测方法主要依靠根据细菌的营养需求和代谢产物的不同而设计的常规生理生化检测，但是该方法费时费力，且结果不可靠(LamyB,LaurentF,VerdierL等.“Accuracyof6CommercialSystemsforIdentifyingClinicalAeromonasIsolates”[J].DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease,2010,67:9-14)。也有依赖表观病理观察和细菌分离鉴定等一般细菌学方法来检测维氏气单胞菌的，但维氏气单胞菌引发疾病的病理现象与其他气单胞菌极为相似，很难肉眼判定，而常规的细菌分离鉴定又耗时耗力。此外，也可应用分子生物学和免疫学方法。分子生物学方法基于特定保守序列，如16srDNA(ChacónMR,Castro-EscarpulliG,SolerL等.“ADNAProbeSpecificforAeromonasColonies”[J].DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease,2002,44:221-225)或16S-23SrRNA的基因间隔区(ISR)(LaganowskaM,KaznowskiA.“RestrictionFragmentLengthPolymorphismof16S-23SrDNAIntergenicSpacerofAeromonasspp”[J].SystemApplMicrobiol,2004,27:549-557)的长度和序列变化进行细菌的鉴别和分类，但是该方法使用的一般探针假阳性率偏高、价格昂贵。另外，维氏气单胞菌的ISR种类较多，不利于检测，也有研究表明维氏气单胞菌的ISR相似性很高(LAGANOWSKAM,KAZNOWSKIA.“Restrictionfragmentlengthpolymorphismof16S-23SrDNAintergenicspacerofaeromonasspp”[J]SystApplMicrobiol,2004,27(5):549－557)，分歧尚未统一。可见，维氏气单胞菌的分子生物学鉴定方法尚不成熟。免疫学方法，即通过特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细菌特异的抗原性蛋白质，也研究不足，尚未鉴定出能够特异鉴定维氏气单胞菌的大量抗原(AroraS,AgarwalRK,BistB.“ComparisonofELISAandPCRvis-à-visCulturalMethodsforDetectingAeromonasspp.inFoodsofAnimalOrigin”[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2006,106:177-183)因此，总体而言，维氏气单胞菌的检测方法仍处于滞后阶段，以致于水产动物特别是人类感染致病菌时经常发生误诊，往往引起严重的后果——养殖水产动物大量死亡和病人病情持续甚至死亡。因此，发展一种能够快速、简便地检测维氏气单胞菌的方法，是今后对维氏气单胞菌引起的疾病开展预防和治疗的关键和重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种维氏气单胞菌的检测引物对，该引物对特异性强、灵敏度高，能够快速、准确地检测维氏气单胞菌。本专利技术的另一个目的是提供一种检测维氏气单胞菌的试剂或试剂盒，其灵敏度高、快速、简便、成本低。本专利技术的另一个目的是提供一种检测维氏气单胞菌的方法，该方法使用本专利技术的上述引物对、试剂或试剂盒，可以快速、方便、准确地鉴定维氏气单胞菌的存在。或者，本专利技术另一目的是提供本专利技术上述引物对、试剂或试剂盒在制备用于检测维氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测维氏气单胞菌的引物对，其中：(1)所述引物对的正向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1或由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列；以及(2)所述引物对的反向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.2或由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.用于检测维氏气单胞菌的引物对，其中：(1)所述引物对的正向引物的核苷酸序列选自SEQIDNO.1或由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列；以及(2)所述引物对的反向引物的核苷酸序列选自SEQIDNO.2或由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的引物对，其中所述引物对中的一条引物被可检测地标记。3.如权利要求2所述的引物对，其中所述标记选自放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质或生物素。4.如权利要求1-3任一项所述的引物对，其中：所述引物对是引物对WP_041202141.1，其正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.用于检测维氏气单胞菌的试剂，所述试剂包含如权利要求1-4任一项所述的引物对。6.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-4任一项所述的引物对或权利要求5所述的试剂。7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含至少一条TaqMan探针，以进行实时荧光定量PCR。8.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含2×PCRmasterMix、阳性对照以及10xPCR菌落增强剂。9....

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，刘柱，唐燕琼，唐鸿倩，胡新文，马香，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46