本发明专利技术涉及动物疫病检测技术领域，特别涉及一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒。该试剂盒包括：p27蛋白、GroEL‑Δ8‑1蛋白、酶标记的第二抗体、BSA、包被液、封闭液、显色液和终止液。本发明专利技术用禽白血病病毒保守区p27的原核表达蛋白和鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL的截短体GroEL‑Δ8‑1的原核表达蛋白为包被抗原开发出能够同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒，本发明专利技术的试剂盒能够同时检测禽白血病和鸡白痢，只要检测为阳性的鸡即淘汰，达到同时净化的目的，极大地减轻临床检测净化的工作。
A kit for simultaneous detection of antibodies against avian leukosis virus and Salmonella pullorum antibody
The invention relates to the technical field of animal epidemic disease detection, in particular to a reagent kit for simultaneous detection of avian leukemia virus antibody and Salmonella pullorum antibody. The kit consists of p27 protein, GroEL_8_1 protein, enzyme-labeled second antibody, BSA, coating solution, blocking solution, chromogenic solution and terminating solution. An indirect ELISA kit for simultaneous detection of avian leukemia virus antibodies and Salmonella pullorum antibodies is developed by using the prokaryotic expression protein of p27 conserved region of avian leukemia virus and the truncated prokaryotic expression protein of GroEL_8_1 of the dominant antigen of Salmonella pullorum as coating antigen. It can detect avian leukemia and chicken white diarrhea at the same time, so long as the positive chicken is eliminated, so as to achieve the purpose of purification at the same time, greatly reducing the clinical detection and purification work.
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒
本专利技术涉及动物疫病检测
，特别涉及一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒。
技术介绍
禽白血病(AvianLeukosis)是由禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus,ALV)和禽肉瘤病病毒(AvianSarcomaVirus,ASV)群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。该病对鸡能引起许多种具有传染性的良性和恶性肿瘤。自1868年Roloff报道鸡淋巴肉瘤以来，禽白血病已分布于世界各地，我国也有自然病例发生。该病可引起鸡只增重缓慢、性成熟延迟、蛋小、蛋壳薄、产蛋量下降、受精率和孵化率低、胴体废弃率增加、死亡率增高等，造成直接经济损失。同时还可引起机体非特异性抵抗力下降和免疫抑制，造成间接经济损失。由于该病能垂直传播，因此对养禽业危害很大，是危害养鸡业的主要疾病之一。鸡白痢(PullorumDisease)是由鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum,SP)引起的，以雏鸡为主要感染对象，以排白色粪便和产蛋下降为主要特征，可致产前各日龄鸡败血性伤寒症的禽类急性传染病。鸡白痢沙门氏菌的传播方式呈多样性，不仅可通过饲料、空气、饮水、鼠类等进行水平传播，也可通过产带菌卵进行垂直传播，孵化出的病雏绒毛中携带的大量病原菌，可污染饮水、育雏器、饲料等，通过消化道、呼吸道等感染同鸡舍的幼雏，耐过鸡只成年后再排带菌卵，由此形成复杂的传播网络。鸡白痢沙门氏菌在国内感染率高，分布广，是种禽养殖净化的重点，也是商品蛋鸡养殖重点防治的疾病。禽白血病和鸡白痢都是可以垂直传播的传染病，对养鸡业造成严重的危害。目前控制禽白血病和鸡白痢最有效的措施是实施传染病的净化，主要通过定期对种鸡群进行检疫，淘汰阳性鸡，通过不断地净化从而选育出无禽白血病和鸡白痢的鸡群。各国在众多检测方法中，ELISA检测方法以其敏感、特异、操作方便而被广泛应用于临床检测。该法适合于基层兽医部门和鸡场对该病的诊断和血清学检测。禽白血病病毒的p27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。其编码的p27蛋白是病毒核心外壳的主要成分，其含量高，占病毒总蛋白成分的30％以上，能够诱导机体产生特异性抗体。Heat-shockprotein60(GroEL)是鸡白痢沙门氏菌重要的蛋白抗原，在鸡白痢沙门氏菌入侵机体时可诱导产生大量抗体。因此，可以用p27和GroEL作为包被抗原，建立检测禽白血病和鸡白痢抗体的间接ELISA检测试剂盒。目前主要的禽白血病和鸡白痢检测试剂盒种类如表1所示：表1禽白血病和鸡白痢检测试剂盒统计禽白血病和鸡白痢都是养鸡场需要净化的传染病，目前对禽白血病的净化主要是用国外ELISA试剂盒检测鸡泄殖腔拭子的禽白血病病毒抗原p27和鸡血清的禽白血病抗体，对鸡白痢的净化主要用平板凝集试验检测鸡血清的鸡白痢沙门氏菌抗体，这些试剂盒或方法都是针对单一传染病的检测，还没有一种单一试剂盒能够检测禽白血病和鸡白痢这两种病。单独检测禽白血病的试剂盒和平板凝集试验单独检测鸡白痢的方法，使临床检测净化禽白血病和鸡白痢工作耗费大量的人力、物力和财力。因此迫切需要研制出方便好用的禽白血病和鸡白痢检测试剂盒，减轻禽白血病和鸡白痢的净化工作。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒。该试剂盒能够同时检测禽白血病和鸡白痢，只要检测为阳性的鸡即淘汰，达到同时净化的目的。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒，包括：p27蛋白、GroEL-Δ8-1蛋白、酶标记的第二抗体、BSA(牛血清白蛋白)、包被液、封闭液、显色液和终止液。本专利技术结合禽白血病和鸡白痢要同时净化的现状，利用ELISA(酶联免疫吸附测定)的基本原理，用禽白血病病毒保守区p27的原核表达蛋白和鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL的截短体GroEL-Δ8-1的原核表达蛋白为包被抗原开发出能够同时检测禽白血病和鸡白痢的ELISA试剂盒。通过摸索最佳的p27和GroEL-Δ8-1包被条件，优化ELISA的反应条件建立同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的间接ELISA方法。与目前常用的单独检测禽白血病或鸡白痢的试剂盒相比，本专利技术的试剂盒能够同时检测禽白血病和鸡白痢，只要检测为阳性的鸡即淘汰，达到同时净化的目的，极大地减轻临床检测净化的工作。作为优选，酶标记的第二抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG。作为优选，包被液为pH为9.6的包被液。作为优选，封闭液为脱脂乳。优选地，封闭液为质量百分浓度为5％的脱脂乳。作为优选，BSA为质量百分浓度为0.5％的BSA。作为优选，显色液为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液。在本专利技术中，p27蛋白的制备方法为：采用SEQIDNO：1所示上游引物和SEQIDNO：2所示下游引物扩增得到p27基因片段，将p27基因插入原核表达载体，转入表达宿主，经诱导表达、收集菌体、裂解、纯化，得到p27蛋白。在本专利技术中，GroEL-Δ8-1蛋白的制备方法为：采用SEQIDNO：3所示上游引物和SEQIDNO：4所示下游引物扩增得到GroEL-Δ8-1基因片段，将GroEL-Δ8-1基因插入原核表达载体，转入表达宿主，经诱导表达、收集菌体、裂解、纯化，得到GroEL-Δ8-1蛋白。作为优选，p27蛋白和GroEL-Δ8-1蛋白在包被时的总浓度为4μg/mL。作为优选，GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白在包被时的质量比为1:2。作为优选，试剂盒还包括酶标板和/或PBST缓冲液。本专利技术提供了一种同时检测禽白血病和鸡白痢的方法，包括如下步骤：(1)抗原包被：以GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白作为抗原，包被液稀释抗原，包被总浓度为0.25～8μg/mL，GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白的质量比为1:0.125～1:8，4℃包被8～12h；(2)洗涤；(3)封闭：酶标板内加入封闭液脱脂乳，37℃封闭0.5～3h。(4)洗涤；(5)抗原抗体反应：用BSA稀释血清至1：50～1：800，加入酶标板内，37℃孵育30～90min；(6)洗涤；(7)酶标抗体反应：用BSA稀释酶标记的第二抗体母液至1：2000～1：16000，加入酶标板内，37℃孵育15～90min；(8)洗涤；(9)显色：将显色液加入酶标板内，在15～30℃条件下显色5～20min；(10)终止：加入终止液终止反应；(11)读数：检测OD450nm值；(12)判断：当检测血清的OD450nm值大于阴阳性临界值(标准阴性样品的均值+3×标准阴性样品的标准差)，则检测血清中含有禽白血病病毒抗体或鸡白痢沙门氏菌抗体中的一种或两种。作为优选，包被液为pH为9.6的包被液。作为优选，封闭液为质量百分浓度为5％的脱脂乳。作为优选，封闭的温度为37℃，封闭的时间为2h。作为优选，BSA为质量百分浓度为0.5％的BSA。作为优选，显色液为TMB显色液。作为优选，p27蛋白和GroEL-Δ8-1蛋白在包被时的总浓度为4μg/mL。作为优选，GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白在包被时的质量比为1:2。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒，其特征在于，包括：p27蛋白、GroEL‑Δ8‑1蛋白、酶标记的第二抗体、BSA、包被液、封闭液、显色液和终止液。
【技术特征摘要】
1.一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒，其特征在于，包括：p27蛋白、GroEL-Δ8-1蛋白、酶标记的第二抗体、BSA、包被液、封闭液、显色液和终止液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的第二抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液为pH为9.6的包被液。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为脱脂乳。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述BSA为质量百分浓度为0.5％的BSA。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB显色液。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述p27蛋白的制备方法为：采用SEQIDNO：1所示上游引物和SEQIDNO：2所示下游引物扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑世军，王永强，游广炬，李晓齐，曹红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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