与鸭跖草除草剂抗性相关的基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及与鸭跖草除草剂抗性相关的基因及其应用，该基因是YZC‑psbA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因编码的SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第264位氨基酸的密码子发生AGT‑GGT碱基突变，使鸭跖草具有三氮苯类除草剂抗性。本发明专利技术还提供了用于检测该基因的特异性引物和方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.3‑4所示，采用该引物对能够实现对田间疑似抗三氮苯类除草剂鸭跖草的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性鸭跖草的科学治理，具有良好的特异性和敏感性，方法准确可靠，操作简便。

Genes related to herbicide resistance in the leaves of A. communis and their application

The present invention relates to a gene related to herbicide resistance and its application. The gene is YZC_psbA. The nucleotide sequence of YZC_psbA is shown in SEQ ID No. Resistance. The invention also provides a specific primer and a method for detecting the gene. The sequence of the specific primer pair is shown in SEQ ID NO.3_4. The primer pair can be used to realize the rapid identification of the suspected triazole-resistant herbicide in the field and the identification of the mutation site, thus guiding the production practice of the resistant herbicide. Scientific management has good specificity and sensitivity. The method is accurate, reliable and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
与鸭跖草除草剂抗性相关的基因及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及与鸭跖草除草剂抗性相关的基因YZC-psbA，与鸭跖草除草剂抗性相关的分子标记、以及检测YZC-psbA基因的方法。
技术介绍
绿色植物叶绿体光系统Ⅱ的D1蛋白是三氮苯类除草剂的作用靶标，由psbA基因编码。三氮苯类除草剂的开发及使用始于上世纪50年代初期，至今已有60多年的使用历史，目前有39个产品，主要有莠去津、西玛津、扑草净、嗪草酮、特丁津等。该类除草剂因其具有杀草谱广，选择性强，生物活性高，廉价等优点而被广泛应用。莠去津作为玉米田最经济、有效的苗前苗后除草剂，对防控鸭跖草等玉米田杂草具有举足轻重的作用。但是，由于该类除草剂分子靶标单一，高频度大量使用，易引起杂草抗药性。近年来，鸭跖草对莠去津的敏感性下降，田间推荐剂量的莠去津已无法有效防除鸭跖草，从而导致鸭跖草在我国东北地区玉米田发生呈上升态势，对莠去津已产生了耐受性。并且，农民对农药科学使用知识不足，生产上盲目增大除草剂试验剂量，导致成本增加，药害风险加大，严重影响了农作物的效益和粮食安全。为了延缓鸭跖草对三氮苯类除草剂抗性的发生和蔓延，开发简便、快速的抗药性鸭跖草田间早期诊断监测方法迫在眉睫。我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用温室盆栽法，即对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在温室内进行种植培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量，计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面：一是不能当季、当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。目前，还没有关于鸭跖草psbA基因克隆及其在抗除草剂抗性检测方面的应用报道，而生产上急需要这样一项技术，用来实时监测和检测鸭跖草对三氮苯类除草剂的抗性，以便做到及时发现和治理，防治抗药性鸭跖草的扩散和蔓延。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种鸭跖草除草剂抗性相关的基因YZC-psbA及其应用。本专利技术的另一个目的是提供YZC-psbA基因上与除草剂抗性相关的分子标记及其应用。本专利技术提供的鸭跖草除草剂抗性相关的基因YZC-psbA其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了基因YZC-psbA在检测除草剂抗性鸭跖草中的应用。所述的除草剂为三氮苯类除草剂。本专利技术提供了与鸭跖草除草剂抗性相关的分子标记，该分子标记是核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的YZC-psbA基因编码的SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的第264位氨基酸的密码子发生AGT-GGT碱基突变；所述除草剂为三氮苯类除草剂。本专利技术提供了上述分子标记在治理田间杂草中的应用。优选地，所述的杂草为鸭跖草。本专利技术提供了上述分子标记在检测具有抗三氮苯类除草剂能力的鸭跖草中的应用。本专利技术提供了用于检测鸭跖草YZC-psbA基因的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示。引物对I：正向引物YZC-psbA-IF：5'-CTATTGAGATTGGTTGACATT-3'(SEQIDNO.3)反向引物YZC-psbA-IR：5'-TGGTTTATTCCGCAGCAGCA-3'(SEQIDNO.4)另一方面，本专利技术提供了用于检测除草剂抗性鸭跖草的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示。本专利技术还提供了一种检测抗三氮苯类除草剂鸭跖草的方法，包括以下步骤：(1)提取样品基因组DNA，以其为模板，利用上述特异性引物进行PCR扩增反应；(2)对扩增产物片段测序，若1548bp片段的第932位碱基发生突变，则待测样品为具有抗三氮苯类除草剂能力的鸭跖草。进一步地，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以15μL计为：鸭跖草基因组DNA0.5μL，10×PCRBuffer1.5μL，2.5mMdNTPMixture1μL，10μM正、反向引物各0.3μL，TaqDNA聚合酶0.3μL，余量为水。进一步地，步骤(1)中PCR扩增反应的条件为：95℃预变性1分钟；94℃变性1分钟，51.5℃退火1分钟，72℃延伸70秒，共35个循环；72℃延伸10分钟。含有本专利技术上述特异性引物对的试剂盒属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了上述特异性引物对或含有该引物对的试剂盒在治理田间杂草用药指导中的应用。优选地，所述的杂草为鸭跖草。本专利技术提供了上述特异性引物对或含有该引物对的试剂盒在检测抗三氮苯类除草剂鸭跖草中的应用。本专利技术根据鸭跖草的YZC-psbA序列信息(SEQIDNo.1)设计出SEQIDNO.3-4所示的特异性引物对，采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性试验证明(图1)能够将鸭跖草的psbA基因检测出来。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，当季就可以取样检测，从取样到出结果仅需2～4天。其灵敏度和特异性能够实现对田间疑似抗三氮苯类除草剂鸭跖草的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。本专利技术提供的用于检测抗三氮苯类除草剂鸭跖草的试剂盒，可对田间采集的疑似具有三氮苯类除草剂抗性的鸭跖草进行快速检测。可以替代一直沿用的生物测定的传统检测方法，并适于在其他除草剂抗性杂草的监测领域中广泛开发应用，实用性强，可满足田间除草剂抗性杂草快速诊断的需要。附图说明图1为实施例1中引物对psbA基因的扩增电泳图。图2为实施例1中5’和3’末端染色体步移扩增电泳图。图3为实施例2中引物对psbA基因的扩增电泳图。1:MarkerDL2000；2:鸭跖草psbA基因扩增条带。图4A为鸭跖草野生型和突变型psbA基因保守区域264位氨基酸序列比对及扩增情况。图4B为鸭跖草野生型psbA基因保守区域264位附近序列，图4C为鸭跖草突变型psbA基因保守区域264位附近序列。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1鸭跖草psbA基因的克隆由于目前尚未有关鸭跖草psbA基因的报道，考虑到单子叶植物中psbA基因的同源性较高，因此选择NCBI中水稻psbA(OryzasativaL.，登录号：NC_031333.1)序列作为参考序列，结合拟南芥的psbA(ArabidopsisthalianaL.，登录号：NC_000932.1)保守区域进行序列比对，根据引物设计原则，利用软件primerpremier5.0设计第一组引物，见表1。表1扩增鸭跖草psbA基因引物(第一组)引物编号序列5'-3'F1ATCGGATGGTTCGGTGTTR1GAGGGAAGTTGTGAGCATTACGF2TCGGATGGTTCGGTGTTTR2GAGGGAAGTTGTGAGCATTACGF3TATTATCGCCTTCATCGCR3GCATTACCTCCATACCAAPCR扩增体系(15μL)如下：温度梯度PCR反应条件如下：取PCR反应液3μL用1％的Agarose凝胶电泳，第1组引物温度梯度扩增结果如图1所示，以上引物能扩增出单一目的条带。将PCR产物连接到载体并转化大肠杆菌后进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鸭跖草除草剂抗性相关的基因YZC‑psbA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.鸭跖草除草剂抗性相关的基因YZC-psbA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示或具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。2.权利要求1所述的基因YZC-psbA编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示或具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。3.与鸭跖草除草剂抗性相关的分子标记，其特征在于，该分子标记是核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的YZC-psbA基因编码的SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的第264位氨基酸的密码子发生AGT-GGT碱基突变；所述除草剂是为三氮苯类除草剂。4.权利要求1所述的基因YZC-psbA或权利要求3所述分子标记在治理田间杂草中的应用。5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李香菊，杨娟，崔海兰，于海燕，房贤豪，于惠林，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11