一种花生抗逆性基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种花生抗逆性基因及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的抗逆性基因序列如SEQ ID No.1或者SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。构建该基因的植物表达载体和微生物表达载体，并将其分别转化到植物和微生物体内，可以增强植物和微生物的耐盐性。

A peanut resistance gene and its application

The invention discloses a peanut stress resistance gene and its application, belonging to the field of biotechnology. Sequences of stress-resistant genes such as SEQ ID No.1 or SEQ ID No.1 are replaced, deleted or added with one or more bases and encode the same functional protein. The salt tolerance of plants and microorganisms can be enhanced by constructing plant expression vectors and microbial expression vectors and transforming them into plants and microorganisms respectively.

【技术实现步骤摘要】
一种花生抗逆性基因及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种花生抗逆性基因及其应用。
技术介绍
生物在自然环境中经常要面对各种不利条件(如干旱、盐胁迫、低温等)胁迫；这些不利条件能够抑制生物的生长，甚至导致生物体死亡。随着环境的不断恶化，盐碱等逆境胁迫已经成为世界性的问题，培育具有多种抗逆性的生物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。目前，通常采用常规杂交方法选育生物新品种。当前发展迅速的基因工程技术为生物遗传改良提供了新的途径，利用在盐胁迫应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得耐盐新种质的重要手段。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种花生抗逆性基因及其应用。为了到达上述目的，本专利技术的技术方案为：一种抗逆性基因，其序列如SEQIDNo.1或者SEQIDNo.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。在上述方案的基础上，克隆该基因的引物序列为：P1：5'GTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC3'；P2：5'TCAACAACCAACTGATTAAACCACC3'。扩增所述抗逆性基因任一片段的引物也属于本专利技术的保护范围。在上述方案的基础上，其序列具有2个外显子，对应的碱基分别为第14-354，1083-1092位。含有上述花生抗逆性基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。上述花生抗逆性基因编码的蛋白。在上述方案的基础上，所述花生抗逆性基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.2经一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白。上述花生抗逆性基因或其编码的蛋白在提高生物抗逆性中的应用。在上述方案的基础上，所述的生物为植物和微生物；优选的，所述植物为拟南芥，所述微生物为大肠杆菌。在上述方案的基础上，所述的抗逆性为耐盐性。一种提高植物耐盐性的方法，将上述花生抗逆性基因构建到植物表达载体，导入植物细胞中，使其在植物中表达，获得高耐盐性植株。一种提高微生物耐盐性的方法，将上述花生抗逆性基因构建到表达载体，导入微生物细胞中，使其在微生物细胞中表达，获得高耐盐性菌株。本专利技术的有益效果：1、本专利技术从花生中克隆到一条抗逆性基因，测序结果表明该基因有2个外显子，分别对应的碱基为14-354，1083-1092，将其命名为nsLTP1。2、构建nsLTP1基因的植物表达载体，并转化拟南芥；结果表明：转入nsLTP1基因的拟南芥植株形态发育正常，转nsLTP1基因拟南芥苗至少可以抗100mMNaCl的胁迫；nsLTP1基因在拟南芥中表达可显著提高其耐盐性。3、构建nsLTP1基因的原核表达载体，并转化大肠杆菌，重组菌可以抗7.5％NaCl的胁迫。附图说明图1nsLTP1基因在花生盐胁迫处理后的表达情况；图2转基因拟南芥耐盐性分析(左边为转基因组，右边为对照组)；图3转基因大肠杆菌耐盐性分析(A为转入空载pET22b，B为转入pET22b-nsLTP1)。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存；1、花生抗逆性相关基因的克隆以花生的基因组DNA为模板，以引物对：P1：5'GTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC3'SEQIDNo.3；P2：5'TCAACAACCAACTGATTAAACCACC3'SEQIDNo.4；扩增花生抗逆性相关基因，其基因序列如SEQIDNo.1所示；测序结果表明该基因有2个外显子，分别对应的碱基为14-354，1083-1092，将其命名为nsLTP1。2、nsLTP1在花生盐胁迫处理后的表达情况(1)用0.7％NaCl处理“花育23号”的幼苗，在处理后0h、6h、12h、24h、48h取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNaseI处理，并进行纯化。(2)样品在ABI7500FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。20μL反应体系包括：10μL2×SybrGreenqPCRMasterMix，20μmol/L正反向引物各0.25μL，20ng反转录产物。扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。结果如图1。(3)nsLTP1基因定量PCR引物为正向引物序列为5'-CATGGCCTTGGTGGGTG-3'(SEQIDNo.5)；反向引物序列为5'-CTTGCGGTCGGCAGTAG-3'(SEQIDNo.6)。内标基因Actin的正反向引物序列为：正向引物序列为5'-GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3'(SEQIDNo.7)；反向引物序列为5'-ATGGATGGCTGGAAGAGAACT3'(SEQIDNo.8)。nsLTP1基因在盐胁迫处理前后表达量变化明显，表明其表达受盐胁迫诱导(如图1所示)。实施例2根癌农杆菌菌株GV3101购自北京天恩泽基因科技有限公司；转基因的受体材料为拟南芥野生型品种由青岛农业大学遗传研究室实验室提供。1、nsLTP1基因植物表达载体的构建以花的基因组DNA为模板，在扩增时分别在上下游引物中加入KpnI和SacI酶切位点。P3：5'-GGTACCGTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC-3'(KpnI)(SEQIDNo.9)；P4：5'-GAGCTCTCAACAACCAACTGATTAAACCACC-3'(SacI)(SEQIDNo.10)。回收PCR产物，并在T4DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-T(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含nsLTP1基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体Super1300的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体Super1300-nsLTP1。2、表达载体转化拟南芥(1)农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将Super1300-nsLTP1重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株GV3101感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mLYEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培养基中，培养到OD600＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体1/2MSB5悬浮备用。(2)拟南芥的种植：选取合适的的拟南芥种子，在1％NaClO中浸泡5min，无菌水冲洗4-6次。点种到基质土上。(3)农杆菌介导的遗传转化：选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗逆性基因，其特征在于：其序列如SEQ ID No.1或者SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗逆性基因，其特征在于：其序列如SEQIDNo.1或者SEQIDNo.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。2.根据权利要求1所述抗逆性基因，其特征在于：克隆该基因的引物序列为：P1：5'GTCCAATACTATTATGGCTAGCCTC3'；P2：5'TCAACAACCAACTGATTAAACCACC3'。3.根据权利要求1或2所述花生抗逆性基因，其特征在于：其序列具有2个外显子，对应的碱基分别为第14-354，1083-1092位。4.含有权利要求1～3任一项所述花生抗逆性基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋炯明，禹山林，王晶珊，乔利仙，杨庆利，衣艳君，张芳，汤松，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37