用来筛查传染病基因和遗传改变的带有条码的微阵列芯片及使用方法技术

本发明专利技术为用来筛查传染病基因和遗传改变的带有条码的微阵列芯片及使用方法，描述了用于检测试样中传染性微生物或者试样中DNA和/或RNA样品的基因突变和数量改变的检测方法。在各种实施例中，所述方法包括用同时含有条码和特异靶标序列寡核苷酸的引物进行多重聚合酶链式反应(PCR)。PCR产物，被通用引物上的荧光染料标记，然后与条码特异的寡核苷酸杂交并被印到微阵列芯片的固体基质上。该方法可以用于筛查大量传染性微生物或与疾病有关的基因突变，基因考贝数或基因表达水平的改变，包括癌症和遗传疾病。经系列稀释后被印到微阵列芯片上的条码特异寡核苷酸也可以用于PCR产物的定量，对试样中存在的靶标序列进行半定量。本发明专利技术所述组分、设备和方法为检测和定量多种靶标序列，包括基因突变，提供了快速筛查检测。

Bar code microarray chip for screening infectious disease gene and genetic change and its usage

A method for detecting gene mutations and quantitative changes in DNA and/or RNA samples of infectious microorganisms or samples of infectious microorganisms in a sample is described for screening genes and genetic changes in infectious diseases by using a bar-coded microarray chip and its usage. In various embodiments, the method includes multiplex polymerase chain reaction (PCR) using primers containing both barcode and specific target sequence oligonucleotides. PCR products are labeled with fluorescent dyes on universal primers, then hybridized with barcode-specific oligonucleotides and printed on the solid substrate of microarray chips. The method can be used to screen for a large number of infectious microorganisms or disease-related gene mutations, changes in gene cobey count or gene expression levels, including cancer and genetic diseases. Bar code specific oligonucleotides, which are diluted and printed on microarray chips, can also be used to quantify PCR products and semi-quantify the target sequences in the samples. The components, equipment and method of the invention provide rapid screening detection for detecting and quantifying multiple target sequences, including gene mutations.

【技术实现步骤摘要】
用来筛查传染病基因和遗传改变的带有条码的微阵列芯片及使用方法
总的来说本专利技术涉及分子生物学、微生物学和肿瘤学领域。本专利技术的各个部分包括用于检测含有DNA和RNA的核苷酸的各种组分、设备和方法，为传染性疾病和癌症的诊断和处理提供定性和定量信息。进一步，本专利技术的所述部分包括用同时含有条码和靶标序列特异寡核苷酸的引物进行多重聚合酶链式反应(PCR)并用印刷在微阵列芯片上与条码互补的寡核苷酸对PCR产物进行分析。本专利技术所述各种组分、设施和方法为多种靶标序列的检测和定量提供了快速测定方法，包括基因突变。
技术介绍
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技术介绍
用于帮助读者理解本专利技术，而不能被认为是现有技术。基因组是生物的全部基因或遗传物质。由编码构成和维持生物所需的所有信息的核苷酸组成。术语“核苷酸”是本领域公知的。这里所述的“核苷酸”一般指DNA、RNA分子或它们的衍生物，包括碱基。碱基包括，例如，DNA(如腺嘌呤“A”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘌呤“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(如一个A,一个G一个尿嘧啶“U”或C)中出现的自然产生或衍生的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核苷酸”包含术语“寡核苷酸”和“多聚核苷酸”，它们都是术语“核苷酸”的亚属。术语“寡核苷酸”为长度在3至100个碱基之间的分子。术语“多聚核苷酸”指长度至少大于100个碱基的单个分子。总的来说这些定义指一个单链分子，但在特定实施例中也可以包括与单链分子的局部、基本上或全部互补的另外一条链。因此核苷酸也包括双链分子或三链分子，其包含特定序列的一个或多个互补链或“互补物”，这个特定序列包括分子。聚合酶链式反应(PCR)是通过DNA聚合酶(1、2)扩增靶标(或模板)DNA分子的技术。这个技术在临床实验室和研究工作实验室被用于各种用途，包括分子克隆、DNA测序、突变分析、疾病诊断、重组蛋白合成和识别个体的法医鉴定。该方法依赖热循环的加热和冷却的重复循环，这样的结果是DNA通过DNA聚合酶解链和复制。一对被称为引物的短DNA寡核苷酸单链被用于靶标区域的特异扩增。引物序列与部分靶标序列互补。PCR反应一般在热循环仪中的反应溶液中进行。反应溶液通常包括下列成分：含有待扩增DNA区域的DNA模板；与DNA靶标的每一条链的3'端互补的引物；热稳定的DNA聚合酶例如TaqDNA聚合酶，PfuDNA聚合酶或VentDNA聚合酶；脱氧核苷三磷酸盐(dNTPs)；优化DNA聚合酶活力和稳定性的缓冲液，包括钾、镁或锰离子。通过凝胶电泳，或通过与DNA结合的荧光染料或通过用荧光染料标记的与靶序列互补并作为探针的寡核苷酸，PCR产物可以被检测和定量。目前有许多基于PCR技术对目的基因进行检测，但是仍然存在很多缺陷，有待提供改良的方法，对扩增的目标产物进行检测以及改良的方法对目的基因进行扩增。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供一种多重聚合酶链式反应(PCR)与带有条码的微阵列芯片的系统组合用于筛查和检测传染性微生物或筛查疾病相关基因突变或基因表达水平的改变，包括癌症和遗传疾病的方法：该方法包括：进行第一和第二轮PCR反应；其中，第一轮PCR中使用的引物包含具有下列特性的引物对：除了所测试的靶标特异序列以外，第一引物在5'端含有一个额外的条码序列；而引物对的第二引物含有通用引物序列，与所有引物对一样具有相同序列。在一些具体的实施方式中，进行第二轮PCR反应使用的引物由独特的条码寡核苷酸引物和通用引物组成；其中，通用引物用报告分子标记，如生物素、荧光染料、荧光纳米颗粒、量子点或化学发光染料中的一种。在一些具体的实施方式中，所述的报告分子可以是任何允许进行PCR产物检测的分子，包括生物素、荧光染料。当生物素被使用时，标记到卵白素或链霉亲和素上的报告分子发射的信号被用于PCR产物检测。在一些具体的实施方式中，所述的报告分子发射的信号可以是分子，其发出荧光及化学发光，或通过酶促反应发出荧光或化学发光，或像金颗粒一样直接肉眼可见。在一些具体的实施方式中，其中，在所述的条码微阵列芯片是具有成百上千个点的微阵列芯片，每一个点含有独特的条码寡核苷酸用于捕获第二轮PCR中由通用引物合成的DNA链。在一些具体的实施方式中，其中，每一个条码序列可以被印刷在不只一个点上(重复的点)；或者，对于每一个条码序列，具有与条码相同的序列但中间有1个或多个核苷酸位点错配的内标寡核苷酸作为条码被被印刷在微阵列芯片上；优选的，重复点和内标点被用于测定检测的特异性和可重复性。在一些具体的实施方式中，其中，所述的条码微阵列芯片被印刷在固体表面作为芯片，或在多孔道的固体表面，例如96孔板上。在一些具体的实施方式中，其中，该方法或者方法所使用的系统可以被用于临床分析中的床边(POC)诊断检测，食品安全和环境监测。在一些具体的实施方式中，该方法或者方法所使用的系统用于以下检测：引起传染病的微生物是所有引起传染性疾病的微生物，其具有或不具有临床症状。这些传染性微生物中的部分可以引起癌症。在一些具体的实施方式中，，其中，该方法或者方法所使用的系统被用于筛查和检测基因组DNA中的突变。在一些具体的实施方式中，系统包括癌症中突变的检测。在一些具体的实施方式中，系统可以被用于样品中RNA水平的筛查和检测。在一些具体的实施方式中，RNA包括mRNA,小RNA和非编码RNA。RNA水平可以被用于疾病诊断和疾病进展的监控。另一方面，本专利技术提供一种检测目标靶序列的试剂，该试剂包括进行第一和第二轮PCR反应的试剂；其中，第一轮PCR中使用的引物包含具有下列特性的引物对：除了所测试的靶标特异序列以外，第一引物在5'端含有一个额外的条码序列；而引物对的第二引物含有通用引物序列，与所有引物对一样具有相同序列。另一方面，本专利技术提供一种用于检测PCR扩增反应产物的装置，该装置包括带有条码的微阵列芯片，在微阵列芯片包括与PCR扩增反应中使用的引物上的条码序列特异配对的另一条码序列。在一些具体的实施方式中，在所述的条码微阵列芯片是具有成百上千个点的微阵列芯片，每一个点含有独特的条码寡核苷酸用于捕获第二轮PCR中由通用引物合成的DNA链。在一些具体的实施方式中，其中，每一个条码序列可以被印刷在不只一个点上(重复的点)；或者，对于每一个条码序列，具有与条码相同的序列但中间有1个或多个核苷酸位点错配的内标寡核苷酸作为条码被被印刷在微阵列芯片上；优选的，重复点和内标点被用于测定检测的特异性和可重复性。附图说明图1是用多重PCR扩增微生物靶序列的扩增原理分解图。图2是用多重PCR扩增病毒中靶序列的扩增原理分解图。图3是用多重PCR扩增基因组突变的扩增原理分解图。图4是癌症中RNA作为分子标记的检测的原理分解图。图5是利用带有条码序列的微阵列芯片的检测原理分解图。图6是本专利技术的扩增反应与带有条码序列的微阵列芯片进行靶核苷酸进行检测的步骤和原理分解图。图7是用于点突变或靶向等位基因的ARMS分析的阵列的主要步骤流程图。图8是以RNA水平作为生物标记的癌症检测原理分解图。详细说明PCR方法PCR产物经常被用于测序分析来确定序列和基因组改变，或用于分子克隆作靶标序列的功能分析。出于不同的测定目的PCR方法已经被修改。以下是各种PCR的实例：逆转录PCR：该方法用于RNA的检测和定量。在这种情况下，RNA分子首先本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重聚合酶链式反应(PCR)与带有条码序列的微阵列芯片的检测系统(BDLF)组合用于筛查和检测传染性微生物或筛查疾病相关基因组突变，包括癌症和遗传疾病的方法：该方法包括：进行第一和第二轮PCR反应；其中，第一轮PCR中使用的引物包含具有下列特性的引物对：除了所测试的靶标特异序列以外，第一引物在5'端含有一个额外的条码序列；而引物对的第二引物含有通用引物序列，与所有引物对一样具有相同序列。

【技术特征摘要】
1.一种多重聚合酶链式反应(PCR)与带有条码序列的微阵列芯片的检测系统(BDLF)组合用于筛查和检测传染性微生物或筛查疾病相关基因组突变，包括癌症和遗传疾病的方法：该方法包括：进行第一和第二轮PCR反应；其中，第一轮PCR中使用的引物包含具有下列特性的引物对：除了所测试的靶标特异序列以外，第一引物在5'端含有一个额外的条码序列；而引物对的第二引物含有通用引物序列，与所有引物对一样具有相同序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中，进行第二轮PCR反应使用的引物由独特的条码寡核苷酸引物和通用引物组成；其中，通用引物用报告分子标记，如生物素、荧光染料、荧光纳米颗粒、量子微粒或化学发光染料中的一种。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的报告分子可以是任何允许进行PCR产物检测的分子，包括生物素、荧光染料。当生物素被使用时，标记到卵白素或酶联亲和素上的报告分子发射的信号被用于PCR产物检测。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的报告分子发射的信号可以是分子，其发出荧光及化学发光，或通过酶促反应发出荧光或化学发光，或像金颗粒一样直接肉眼可见。5.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥波，方剑秋，
申请(专利权)人：杭州丹威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33