循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途制造技术

一种循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途，所述的循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441的基因序列如SEQ ID NO.1所示。提供了一种用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，含有检测循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441的试剂，试剂包括上游引物序列和下游引物序列，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术发现内异症患者血清中可检测到外泌体TC0101441，并且其表达水平明显高于非内异症女性，因此，循环外泌体TC0101441可成为内异症早期诊断及病情监测的新型非侵入性生物标志物。

Circulating exocrine long chain non coding RNA-TC0101441 as marker for diagnosis of endometriosis

A circulating exosome long-stranded non-coding RNA_TC01441 is used as a marker for the diagnosis of endometriosis. The gene sequence of circulating exosome long-stranded non-coding RNA_TC01441 is shown in SEQ ID NO.1. A reagent kit for the diagnosis of endometriosis containing a reagent for the detection of circulating exosome long-stranded non-coding RNA_TC0101441 is provided. The reagent includes upstream and downstream primer sequences. The upstream primer sequences are shown in SEQ ID NO.2 and the downstream primer sequences are shown in SEQ ID NO.3. It is found that exosome TC0101441 can be detected in the serum of endometriosis patients, and its expression level is significantly higher than that of non-endometriosis women. Therefore, circulating exosome TC01441 can be a new non-invasive biomarker for early diagnosis and disease monitoring of endometriosis.

【技术实现步骤摘要】
循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途
本专利技术属于医学检测领域，涉及一种血清及细胞上清外泌体lncRNA-TC0101441，具体来说是循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441在作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物和在诊断试剂中的用途。
技术介绍
子宫内膜异位症(endometriosis，EMs，简称“内异症”)是一种具有侵袭性，雌激素依赖性的疾病，以子宫内膜的腺体和基质存在子宫体以外的其他部位为特点。子宫内膜异位症的主要临床表现为疼痛和不孕，严重影响女性生活质量。在全球范围内10％-15％的生育年龄女性约有超过7000万人受到内异症的影响。子宫内膜异位症轻度病变可有器官表面的微小病灶，重度病变可导致盆腔脏器肠管、膀胱、输尿管的广泛性粘连。对于早期病变疼痛明显的内异症患者或者晚期病变但症状不明显的患者，腹腔镜检查作为一种有创的诊断方式并不实用。临床上子宫内膜异位症的早期诊断存在延迟现象，有报道称在患有疼痛和不孕症状的妇女中内异症诊断的延迟时间分别为6年和3年。因此，积极探索一种无创性鉴别内异症的生物标志物会降低手术风险，有助于监测内异症的病情进展，促进早期内异症的诊断、干预和治疗。目前在生物标志物中，组织标志物存在标本采集、无法连续监测和随访等诸多限制，不利于临床开展和推广应用。现有的外周血标志物如CA125等特异性差，不足以早期诊断内异症。最近，基于液态活检的循环生物标志物受到重视。液态活检三大来源主要是：循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞和外泌体。外泌体，是细胞外环境的重要成分之一，是30-150nm膜结合分泌囊泡，容易从各种生物体液中分离。外泌体存在于血液、尿液、腹水等人体大多数体液中。外泌体可携带多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质、及遗传物质如信使RNA（messengerRNA，mRNA），微小RNA（microRNA，miRNA）及长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）等。外泌体的稳定性极高，在各种冷冻冷藏和解冻条件下都可保存长达数年，含量也极为丰富，每毫升血浆中就含有10^8-13个外泌体。这些优点赋予了外泌体成为新型标志物的可能性。目前认为，循环血液中的各种RNA是由相关外泌体释放而来，同时也正是由于外泌体的保护，使循环血液中的各种RNA免遭降解。因此，基于液态活检技术探寻外泌体来源的特异性RNA分子，或能为内异症的早期诊断及病情监测带来新的契机。在外泌体的运载成分中，lncRNA受到广泛关注。已有研究表明外泌体可作为功能性lncRNA的运输载体，诱导受体细胞内的表型改变，参与肿瘤的发生发展；并能成为肿瘤诊断，预后预测的潜在标志物。然而在内异症中，国内外均未见外泌体lncRNA的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物用途，所述的这种循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的用途要解决现有技术中对早期诊断子宫内膜异位症困难的技术问题。本专利技术提供了一种循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物用途，所述的循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，含有检测循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的试剂，所述的试剂包括上游引物序列和下游引物序列，所述的上游引物序列如SEQIDNO.2所示，所述的下游引物序列如SEQIDNO.3所示，所述的循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本专利技术发现外泌体TC0101441介导异位内膜间质细胞间的交互对话，促进内异症的侵袭转移，具有监测内异症病情进展的潜能。另一方面，内异症患者血清中可检测到外泌体TC0101441，并且其表达水平明显高于非内异症女性，具有诊断内异症的潜能。因此，液体活检循环外泌体TC0101441可以成为内异症早期诊断及病情监测的新型非侵入性生物标志物。附图说明图1显示了促转移相关lncRNA-TC0101441高表达于内异症患者异位内膜间质组织中。图2显示了鉴定来源于TC0101441敲低及对照异位内膜间质细胞（ECSCs）上清液中的外泌体。图3显示了TC0101441敲低及对照ECSCs上清液所释放的外泌体能被受体细胞内吞。图4显示了外泌体递送TC0101441至受体细胞，诱导受体ECSCs发生类似恶性的侵袭转移表型改变。图5显示了循环血清外泌体TC0101441在内异症患者中的表达显著高于非内异症女性。具体实施方式实施例1内异症患者中异位、在位及正常内膜组织促转移相关lncRNA-TC0101441的表达情况荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）：1）将内异症中异位、在位及正常内膜组织样本固定、脱水；2）在杂交buffer上加入lncRNA-TC0101441探针，用原位杂交试剂盒(Biochain,Hayward,CA,USA)进行原位杂交。3）细胞核用DAPI染色后，用荧光显微镜观察。实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测内异症患者异位、在位及正常内膜组织促转移相关lncRNA-TC0101441的表达情况检测过程：实时荧光定量PCR法：引物序列如下：lncRNA-TC0101441：上游引物5’-caaggcaggtgagaacgagt-3’；下游引物：5’-ctcgacttagggagctgcac-3’；GAPDH：上游引物：5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’；下游引物：5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’；反应体系如下：SYBR○RPremixExTaq10ul；上游引物0.8ul；下游引物0.8ul；cDNA模板2ul；ROXReferenceDyeII0.4ul；RNasefreewater6ul。于ABI7900实时荧光定量PCR仪内进行如下反应：第一步：95℃30秒预变性；第二步：PCR反应，共40个循环，每个循环由95℃5秒变性，60℃34秒延伸。我们发现：TC0101441主要位于异位内膜细胞质中，其在异位内膜中的表达明显高于在位内膜及正常对照内膜。FISH结果（图1A）显示：相比于在位内膜及正常内膜，TC0101441主要表达于异位内膜间质细胞的细胞质中。qRT-PCR结果（图1B）显示：TC0101441在异位内膜中的表达显著高于在位内膜及正常内膜组织。*P<0.05。实施例2异位子宫内膜间质细胞（ECSCs）上清液外泌体的提取及鉴定细胞上清液外泌体提取和鉴定过程：1）原代培养高表达TC0101441的异位子宫内膜间质细胞（3#和5#ECSCs），将ECSCs培养于无血清培养液中3天；2）用siRNA及慢病毒敲低（knockdown，KD）技术敲低3#和5#ECSCs中TC0101441的表达，获得TC0101441敲低及对照ECSCs。3）用外泌体抽提试剂盒#44578259(ThermoFisherSc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物用途，所述的循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物用途，所述的循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的基因序列如SEQIDNO.1所示。2.一种用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，其特征在于：含有检测循环外泌体长链...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱君君，华克勤，唐晓燕，林晓静，郑婷婷，
申请(专利权)人：复旦大学附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：上海,31