一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用，所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成。本发明专利技术针对酿酒酵母传统基因敲除中筛选标记残留，不便进行多基因敲除研究，以及残留外源基因的问题，提供了一种酿酒酵母高效的基因无痕编辑方法。此方法不仅可以用于酿酒酵母的基因编辑，而且可以适用此基因编辑原理的其它微生物。本发明专利技术不仅可用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。

A gene free editing vector and its application in gene editing of organisms

The invention discloses a gene traceless editing vector and its application in gene editing of organisms. The gene traceless editing vector consists of genome homologous sequence A, promoter sequence, cell wall protein CWP1 gene sequence, resistance screening report gene sequence and genome homologous sequence B. Aiming at the problems of screening marker residues in traditional gene knockout of Saccharomyces cerevisiae, inconvenience in multi-gene knockout research, and residue of foreign genes, the invention provides an efficient gene traceless editing method for Saccharomyces cerevisiae. This method can be used not only for gene editing in Saccharomyces cerevisiae, but also for other microorganisms based on the principle of gene editing. The invention can not only be used to study the function and metabolic mechanism of yeast gene, but also can be safely used in industrial production because the obtained mutant does not leave any foreign gene.

【技术实现步骤摘要】
一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用
本专利技术涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种基因无痕编辑的载体及其应用。
技术介绍
酿酒酵母作为模式真菌，既具有原核生物生长迅速操作简单的特点，又具有与高等真核生物相似的基因表达调控机制。目前常用的筛选标记基因，如Cre/Loxp系统、5-FOA均属非自身的外源基因，其生产应用受到限制。因此，有必要开发适用于酵母基因无痕敲除技术，以保证不引入任何外源DNA，便于工程菌的实际应用。去除筛选标记的方法主要有两种：一种是利用重组酶介导的敲除系统，例如Cre/Loxp系统，通过转化筛选标记两侧带有重组酶位点的敲除元件到酵母中，经一步整合实现目的基因的敲除，然后转化另一个编码重组酶的质粒，以实现抗性标记的去除。在工业酵母的改造中，这个系统具有很高的效率，但是其仍会留下外源序列(loxp位点)，并且在进行多基因敲除时，留下的这些位点增大了发生染色体重排的可能性。另一种是在目的基因敲除后，利用敲除元件中正向重复序列之间的同源重组。通过这种方法得到的转化子，其基因组的靶位点上，会残留一个重复序列。CWP1是酿酒酵母细胞壁蛋白1，通过磷酸二酯键与β-1,3-和β-1,6-葡聚糖杂聚物连接到定位于子细胞出生伤痕的细胞壁甘露糖蛋白。CWP1p翻译后经O-糖基化修饰，随后GPI锚定蛋白附着于内质网中的cwp1蛋白上并将其靶向细胞表面，葡糖胺-肌醇磷脂部分被切除，且GPI修饰的甘露糖蛋白通过其无脂GPI聚糖残基共价连接到外部细胞壁层的β-1,6-葡聚糖上。CWP1通过MPK1响应细胞壁摄动的细胞完整性信号传导而受到正向调节，诱导依赖于转录因子RLM1，在厌氧生长过程中下调，由低pH值上调。当Gal启动子高表达CWP1时，细胞形态异常，芽细胞增殖不受细胞调控，致使细胞凋亡。可用此方法筛选出分子内同源重组使Gal-CWP1片段丢失而达到基因无痕编辑的效果。目前，缺乏一种高效的无痕基因敲除方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种基因无痕编辑载体在生物体基因编辑中的应用及其在废水处理领域中的应用。为达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：本专利技术的一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；所述的基因组同源序列A具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；所述的基因组同源序列B具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。进一步地，所述的细胞壁蛋白CWP1基因由CWP1基因或其同源基因构成。进一步地，所述的基因组同源序列A由目的基因上游序列Ⅰ和目的基因下游序列Ⅲ组成，所述序列Ⅰ和序列Ⅲ长度为10-100bp；所述的目的基因上游序列Ⅰ具有SEQIDNo.4的核苷酸序列；所述的目的基因下游序列Ⅲ具有SEQIDNo.5的核苷酸序列。更进一步地，所述的基因组同源序列B由目的基因下游序列两段连续序列Ⅱ和Ⅲ组成，所述的序列Ⅱ和序列Ⅲ长度为10-100bp；所述的目的基因下游序列Ⅱ具有SEQIDNo.6核苷酸序列。进一步地，所述载体筛选标记基因为URA营养筛选标记基因、ADE营养筛选标记基因、HIS营养筛选标记基因、TRP营养筛选标记基因、LEU营养筛选标记基因、G418抗性筛选标记基因、KanMX抗性筛选标记基因、Amp抗性筛选标记基因、潮霉素抗性筛选标记基因Hygr、草甘膦抗性筛选标记基因Bar、natMX抗性筛选标记基因、博来霉素抗性筛选标记基因Bleomcin。本专利技术所述的基因无痕编辑载体在生物体基因编辑中的应用。进一步地，所述的生物体包括原核细胞和真核细胞。本专利技术的一种酿酒酵母基因编辑的载体及基因无痕敲除的方法，包括如下步骤：(1)构建带有Gal-CWP1序列的筛选模板质粒；(2)设计带有目的基因上游同源臂序列Ⅰ、Ⅲ为引物F，目的基因下游同源臂序列Ⅲ为引物R；(3)在模板质粒基础上扩增带有两端同源臂的Gal-CWP1片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组以实现出发菌株的目的基因突变；(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经含半乳糖的丰富合成培养基平板进行筛选，通过分子内同源重组消除Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。进一步地，在步骤(4)中，将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经YPG合成培养基平板反向筛选，使含有同源臂片段的Gal-CWP1基因序列再次发生同源重组，丢失Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。进一步地，在步骤(4)中，所述的筛选培养基为培养酵母菌的YPG培养基。有益效果：本专利技术针对酿酒酵母传统基因敲除中筛选标记残留，不便进行多基因敲除研究，以及残留外源基因的问题，提供了一种酿酒酵母高效的基因无痕编辑方法。此方法不仅可以用于酿酒酵母的基因编辑，而且可以适用此基因编辑原理的其它微生物。本专利技术不仅可用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。附图说明图1为本专利技术pRS306-Gal-CWP1-13myc载体质粒图谱；图2为本专利技术pFA6A-Gal-CWP1-KanMX-3HA载体质粒图谱；图3为本专利技术基因无痕编辑载体的应用的图谱；图4a为本专利技术A.pRS306-Gal-CWP1-13myc载体无痕敲除ADE8基因的结果；ade8Δ::Gal-CWP1:URA3表示整合删除盒和ade8Δ表示删除ADE8基因后的PCR电泳图谱；B.PCR示意图；图4b为本专利技术A.pFA6a-Gal-CWP1-KanMX-3HA载体无痕敲除ADE8基因的结果；ade8Δ::Gal-CWP1:KanMX表示整合删除盒和ade8Δ表示删除ADE8基因后的PCR电泳图谱。B.PCR示意图；图5a为本专利技术菌株ade8Δ::Gal-CWP1:URA3、ade8Δ分别在YPD和SD-Uraˉ固体培养基的生长情况；图5b为本专利技术菌株ade8Δ::Gal-CWP1:KanMX、ade8Δ分别在YPD和YPD+G418(600μg/mL)固体培养基的生长情况。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1本专利技术的一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；所述的基因组同源序列A具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；所述的基因组同源序列B具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。所述的细胞壁蛋白CWP1基因由CWP1基因或其同源基因构成。所述的基因组同源序列A由目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；所述的基因组同源序列A具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述的基因组同源序列B具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；所述的基因组同源序列A具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；所述的基因组同源序列B具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的细胞壁蛋白CWP1基因由CWP1基因或其同源基因构成。3.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因组同源序列A由目的基因上游序列Ⅰ和目的基因下游序列Ⅲ组成，所述序列Ⅰ和序列Ⅲ长度为10-100bp；所述的目的基因上游序列Ⅰ具有SEQIDNo.4的核苷酸序列；所述的目的基因下游序列Ⅲ具有SEQIDNo.5的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因组同源序列B由目的基因下游序列两段连续序列Ⅱ和Ⅲ组成，所述的序列Ⅱ和序列Ⅲ长度为10-100bp；所述的目的基因下游序列Ⅱ具有SEQIDNo.6核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述载体筛选标记基因为URA营养筛选标记基因、ADE营养筛选标记基因、HIS营养筛选标记基因、TRP营养筛选标记基因、LEU营养筛选标记基因、G418抗性筛选标记基因、KanMX抗性筛选标记基因、Amp抗性筛选标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝志敏，曾凡力，胡玉笑，贾艳荣，赵相东，董金皋，申珅，
申请(专利权)人：郝志敏，曾凡力，胡玉笑，
类型：发明
国别省市：河北,13