分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及构建方法技术

本发明专利技术公开了分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及构建方法，其构建步骤为：1)宿主菌Kα的获得：安琪酿酒高活性干酵母进行生孢培养，筛选得到交配型为α型的单倍体菌株，用5‑氟乳清酸平板进行反选得到宿主菌Kα；2)纤维素酶基因表达盒定点整合质粒构建；3)酵母转化与筛选。本发明专利技术的方法能重复使用URA3筛选标记在酿酒酵母工业菌株之衍生菌株中实现多种纤维素酶基因的定点整合并分泌表达。本发明专利技术的重组菌株能有效提高商业化纤维素酶水解纤维素的效率，降低纤维素酶的生产成本，使木质纤维素资源高效转化生产乙醇。

Secreted Cellulase Producing Strain of Saccharomyces cerevisiae and its construction method

The invention discloses an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae secreting and expressing cellulase and a construction method thereof. The construction steps are as follows: 1) acquisition of host bacteria Kalpha; sporulation culture of Angel's high active dry yeast; screening and obtaining haploid strains with mating type alpha; and reverse selection of host bacteria Kalpha with 5_fluorowhey acid plate; and 2) fiber; Construction of site specific integration plasmid for gene expression cassette, 3) yeast transformation and screening. The method can reuse URA3 screening marker to achieve site integration and secretion expression of various cellulase genes in the derived strains of Saccharomyces cerevisiae industrial strains. The recombinant strain of the invention can effectively improve the efficiency of commercial cellulase hydrolysis of cellulose, reduce the production cost of cellulase, and efficiently convert lignocellulose resources into ethanol.

【技术实现步骤摘要】
分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及构建方法
本专利技术属于生物工程
，具体地说，涉及一种分泌表达多种纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及构建方法。
技术介绍
石油、天然气和煤炭等化石能源是当前主要的能源形式，由于它们不可再生，大量消耗必然导致其快速枯竭。寻找能(部分)替代化石能源且污染较少的可再生能源是未来能源发展的一个方向。地球上每年光合作用产生的生物质高达1500-2000亿吨，5％的生物质所含的能量与人类对石油和天然气的需求量相当。生物质中的木质纤维素年产量约为1000亿吨，是自然界中最丰富的碳源，能以可持续的方式为生物燃料和化学品的生产提供潜在原料。因此，以木质纤维素为原料生产生物燃料已成为世界范围内生物燃料技术发展的趋势，其中木质纤维素燃料乙醇的发展力度最强。使用木质纤维素生物转化生产乙醇通常包括生物质预处理、纤维素酶生产、水解和发酵等多个步骤。纤维素酶生产需要单独进行，另外纤维素酶比活力比淀粉酶低100倍以上，木质纤维素乙醇用酶量是淀粉乙醇用酶量的30-50倍，这使得木质纤维素乙醇生产时所用纤维素酶的成本居高不下，成为仅次于原料的一大支出(20％-30％)。为降低成本，需要改进生物质技术，除需在瓶颈问题上(如预处理、酶制剂和发酵菌)有重大技术突破外，过程集成也很重要。将纤维素酶生产、水解和发酵组合在一起的统合生物工艺(consolidatedbioprocessing，CBP)因避免了纤维素酶生产过程中的设备投资、减少原料和其它材料的使用，从而降低水解和发酵成本而被认为是一种有应用前景的技术。该技术的关键是构建一种能有效地将纤维素类多聚糖降解成发酵糖并发酵产醇的微生物。在酿酒酵母中表达纤维素酶，使之具有利用纤维素发酵生产乙醇的能力即是其中的一种策略。经过二、三十年的研究，各种各样的纤维素酶在酿酒酵母中已成功得到表达，但研究多数集中在酿酒酵母实验室菌株，而在工业菌株中的研究还较少。与实验室菌株相比，酿酒酵母工业菌株具有更好的鲁棒性，是纤维素酶表达的更佳宿主。Khramtsov等(KhramtsovN,etal.Industrialyeaststrainengineeredtofermentethanolfromligocellulosicbiomass.BioresourceTechnology,2011,102(17):8310-8313)采用δ整合策略和rDNA同源重组在酿酒酵母工业菌株之衍生菌株K1-V1116染色体上整合了三种纤维素酶基因(Trichodermareeseicbh2、egl2和Aspergillusaculeatusbgl1)，筛选得到的最佳菌株发酵10％预处理过的玉米秸秆，96h后乙醇浓度达到2.6％(v/v)。重组菌株构建中采用了δ整合和rDNA整合，纤维素酶基因整合的位置具有随机性，重组菌株构建难以重复；田沈和杨秀山(田沈,杨秀山.利用展示纤维素酶的酿酒酵母菌群发酵生产乙醇的方法.CN104673689A)在酿酒酵母工业菌株Y5上分别单表面展示了内切葡聚糖酶II、纤维二糖水解酶II和β-葡萄糖苷酶I，得到三个重组菌株，将它们诱导培养后按2:1:1的比例混合后用于纤维素统合生物加工中。重组菌株是一混合菌群，各菌株之间的比例极易受发酵培养条件波动的影响。另外，在酵母表面展示表达纤维素酶，纤维素酶的表达量与细胞表面及直接相关，相反地，在分泌型表达中就没有这样的限制。细胞表面展示的另一个缺点是固定在细胞表面的纤维素酶比分泌型的酶扩散率低。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株。本专利技术的第二个目的是提供一种分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株在纤维素统合生物工艺中的应用。本专利技术的技术方案概述如下：分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株的构建方法，包括如下步骤：1)宿主菌Kα的获得：安琪酿酒高活性干酵母进行生孢培养，筛选得到交配型为α型的单倍体菌株，用5-氟乳清酸平板进行反选得到宿主菌Kα；2)纤维素酶基因表达盒定点整合质粒构建：将SEQIDNO.1所示的DNA片断H1经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H1，再将SEQIDNO.2所示的DNA片断H2经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H1的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU1；将SEQIDNO.3所示的DNA片断H3经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H3，再将SEQIDNO.4所示的DNA片断H4经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H3的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU2；将SEQIDNO.5所示的DNA片断H5经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H5，再将SEQIDNO.6所示的DNA片断H6经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H5的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU3；将SEQIDNO.7所示的DNA片断H7经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H7，再将SEQIDNO.8所示的DNA片断H8经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H7的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU4；将SEQIDNO.9所示的DNA片断H9经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H9，再将SEQIDNO.10所示的DNA片断H10经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H9的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU5；将SEQIDNO.11所示的DNA片断H11经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H11，再将SEQIDNO.12所示的DNA片断H12经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H11的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU6；将SEQIDNO.13所示的DNA片断H13经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H13，再将SEQIDNO.14所示的DNA片断H14经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H13的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU7；将SEQIDNO.15所示的DNA片断H15经HindIII和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：1)宿主菌Kα的获得：安琪酿酒高活性干酵母进行生孢培养，筛选得到交配型为α型的单倍体菌株，用5‑氟乳清酸平板进行反选得到宿主菌Kα；2)纤维素酶基因表达盒定点整合质粒构建:将SEQ ID NO.1所示的DNA片断H1经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H1，再将SEQ ID NO.2所示的DNA片断H2经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H1的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU1；将SEQ ID NO.3所示的DNA片断H3经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H3，再将SEQ ID NO.4所示的DNA片断H4经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H3的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU2；将SEQ ID NO.5所示的DNA片断H5经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H5，再将SEQ ID NO.6所示的DNA片断H6经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H5的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU3；将SEQ ID NO.7所示的DNA片断H7经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H7，再将SEQ ID NO.8所示的DNA片断H8经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H7的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU4；将SEQ ID NO.9所示的DNA片断H9经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H9，再将SEQ ID NO.10所示的DNA片断H10经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H9的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU5；将SEQ ID NO.11所示的DNA片断H11经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H11，再将SEQ ID NO.12所示的DNA片断H12经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H11的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU6；将SEQ ID NO.13所示的DNA片断H13经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H13，再将SEQ ID NO.14所示的DNA片断H14经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H13的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU7；将SEQ ID NO.15所示的DNA片断H15经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H15，再将SEQ ID NO.16所示的DNA片断H16经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H15的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU8；将SEQ ID NO.17所示的DNA片断H17经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H17，再将SEQ ID NO.18所示的DNA片断H18经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H17的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU9；将SEQ ID NO.19所示的DNA片断H19经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H19，再将SEQ ID NO.20所示的DNA片断H20经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H19的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU10；将pUC18‑HRU1、pUC18‑HRU2、pUC18‑HRU3、p...

【技术特征摘要】
1.分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：1)宿主菌Kα的获得：安琪酿酒高活性干酵母进行生孢培养，筛选得到交配型为α型的单倍体菌株，用5-氟乳清酸平板进行反选得到宿主菌Kα；2)纤维素酶基因表达盒定点整合质粒构建:将SEQIDNO.1所示的DNA片断H1经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H1，再将SEQIDNO.2所示的DNA片断H2经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H1的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU1；将SEQIDNO.3所示的DNA片断H3经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H3，再将SEQIDNO.4所示的DNA片断H4经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H3的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU2；将SEQIDNO.5所示的DNA片断H5经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H5，再将SEQIDNO.6所示的DNA片断H6经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H5的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU3；将SEQIDNO.7所示的DNA片断H7经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H7，再将SEQIDNO.8所示的DNA片断H8经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H7的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU4；将SEQIDNO.9所示的DNA片断H9经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H9，再将SEQIDNO.10所示的DNA片断H10经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H9的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU5；将SEQIDNO.11所示的DNA片断H11经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H11，再将SEQIDNO.12所示的DNA片断H12经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H11的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU6；将SEQIDNO.13所示的DNA片断H13经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H13，再将SEQIDNO.14所示的DNA片断H14经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H13的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU7；将SEQIDNO.15所示的DNA片断H15经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H15，再将SEQIDNO.16所示的DNA片断H16经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H15的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU8；将SEQIDNO.17所示的DNA片断H17经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H17，再将SEQIDNO.18所示的DNA片断H18经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR-H17的SmaI-EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18-HRU9；将SEQIDNO.19所示的DNA片断H19经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18-RYUR的HindIII-PstI位点之间，得到质粒pUC18-RYUR-H19，再将SEQIDNO.20所示的DNA片断H20经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪解放，张敏华，邹少兰，马媛媛，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12