一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：(1)提取HCC患者外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因VH、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；以步骤(2)的第一扩增产物为模板；使用Linker‑r和Linker‑s以及带有限制性酶切位点的VH上游引物、所述扩增VH的下游引物再次扩增VH；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增kappa链的上游引物、带有限制性酶切位点的kappa链下游引物再次扩增kappa链；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增lambda链的上游引物、带有限制性酶切位点的lambda链下游引物再次扩增lambda链；得到第二扩增产物；使用带有限制性酶切位点的连接引物将第二扩增产物中的VH、kappa链和lambda链拼接成scFv基因库。

Construction method and kit of a humanized scFv phage antibody library

The invention discloses a method for constructing a fully humanized scFv phage antibody library. The construction method comprises the following steps: (1) extracting the total RNA of peripheral blood mononuclear cells of HCC patients, performing reverse transcription PCR to obtain a cDNA; (2) amplifying the VH, kappa and lambda chains of antibody genes respectively with a cDNA template; and obtaining the first amplified product; The first amplified product of step (2) was used as template; VH was amplified again using Linker_r and Linker_s and VH upstream primers with restriction digestion sites, and the downstream primers with restriction digestion sites; VH was amplified again using Linker_r and Linker_s and the upstream primers with restriction digestion sites, and downstream primers with restriction digestion sites. The second amplification product was obtained by using Linker_r and Linker_s as well as the upstream primers of the amplified lambda chain and the downstream primers of the lambda chain with restriction digestion sites. The VH, kappa and lambda chains in the second amplification product were amplified by using the linked primers with restriction digestion sites. Splice into scFv gene bank.

【技术实现步骤摘要】
一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种HCC患者的全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒在生物治疗和检测方面的应用。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的90％，是中国最常见的且具有破坏性的恶性肿瘤之一，是世界各地癌症死亡的第三位主要原因，其部分致病原因包括高突变率、eVective免疫逃避、抗原性差和血液供应充足。近期，尽管在HCC的诊断和治疗中取得重大进展，几十年来，其五年存活率一直保持在10％左右，在中国，HCC患者特别是晚期患者的治疗选择是有限的，每年大约有12万人死于HCC，在全球，HCC的致死率大约为44％。治疗HCC的传统方法主要包括手术、冷冻手术、经皮乙醇注射、射频热消融、动脉栓塞、化疗栓赛和全身化疗，然而这些疗法对于不可切除的HCC患者，均没有显著疗效，无法改善患者预后。因此，开发新的治疗策略包括免疫疗法等辅助治疗方法具有深远的临床应用意义。抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展，它是噬菌体展示和抗体库两种技术的集成，它的出现有赖于PCR技术的建立、抗体分子在大肠杆菌的功能性表达以及噬菌体展示技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)提取HCC患者外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因VH、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；其中，扩增VH的上游引物为：第一VH上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：5’‑CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG‑3’；第二VH上游引物，序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：5’‑CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG‑3’；第三VH上游引物，序列如SEQ ID NO:3...

【技术特征摘要】
1.一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)提取HCC患者外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因VH、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；其中，扩增VH的上游引物为：第一VH上游引物，序列如SEQIDNO:1所示，具体为：5’-CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3’；第二VH上游引物，序列如SEQIDNO:2所示，具体为：5’-CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG-3’；第三VH上游引物，序列如SEQIDNO:3所示，具体为：5’-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’；第四VH上游引物，序列如SEQIDNO:4所示，具体为：5’-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3’；第五VH上游引物，序列如SEQIDNO:5所示，具体为：5’-GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC-3’；第六VH上游引物，序列如SEQIDNO:6所示，具体为：5’-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3’；扩增VH的下游引物为：第一VH下游引物，序列如SEQIDNO:7所示，具体为：5’-CGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’；第二VH下游引物，序列如SEQIDNO:8所示，具体为：5’-CGCCTCCACCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3’；第三VH下游引物，序列如SEQIDNO:9所示，具体为：5’-CGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3’；第四VH下游引物，序列如SEQIDNO:10所示，具体为：5’-CGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3’；扩增kappa链的上游引物为：第一kappa链上游引物，序列如SEQIDNO:11所示，具体为：5’-TGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCC-3’；第二kappa链上游引物，序列如SEQIDNO:12所示，具体为：5’-TGGCGGATCGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3’；第三kappa链上游引物，序列如SEQIDNO:13所示，具体为：5’-TGGCGGATCGGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC-3’；第四kappa链上游引物，序列如SEQIDNO:14所示，具体为：5’-TGGCGGATCGGACATCGTGATGACCCAGTCTCC-3’；第五kappa链上游引物，序列如SEQIDNO:15所示，具体为：5’-TGGCGGATCGGAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3’；第六kappa链上游引物，序列如SEQIDNO:16所示，具体为：5’-TGGCGGATCGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3’；扩增kappa链的下游引物为：第一kappa链下游引物，序列如SEQIDNO:17所示，具体为：5’-ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3；第二kappa链下游引物，序列如SEQIDNO:18所示，具体为：5’-ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’；第三kappa链下游引物，序列如SEQIDNO:19所示，具体为：5’-ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’；第四kappa链下游引物，序列如SEQIDNO:20所示，具体为：5’-ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3’；第五kappa链下游引物，序列如SEQIDNO:21所示，具体为：5’-ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’；扩增lambda链的上游引物为：第一lambda链上游引物，序列如SEQIDNO:22所示，具体为：5’-TGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC-3’；第二lambda链上游引物，序列如SEQIDNO:23所示，具体为：5’-TGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC-3’；第三lambda链上游引物，序列如SEQIDNO:24所示，具体为：5’-TGGCGGATCGTCCTATGTGCTGACTCAGCCACC-3’；第四lambda链上游引物，序列如SEQIDNO:25所示，具体为：5’-TGGCGGATCGTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3’；第五lambda链上游引物，序列如SEQIDNO:26所示，具体为：5’-TGGCGGATCGCAGCCTGTGCTGACTCARYC-3’；第六lambda链上游引物，序列如SEQIDNO:27所示，具体为：5’-TGGCGGATCGCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC-3’；第七lambda链上游引物，序列如SEQIDNO:28所示，具体为：5’-TGGCGGATCGAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3’；扩增lambda链的下游引物为：第一lambda链下游引物，序列如SEQIDNO:29所示，具体为：5’-ACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’；第二lambda链下游引物，序列如SEQIDNO:30所示，具体为：5’-ACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’；第三lambda链下游引物，序列如SEQIDNO:31所示，具体为：5’-GAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；(3)以步骤(2)的第一扩增产物为模板；使用Linker-r和Linker-s以及带有限制性酶切位点的VH上游引物、所述扩增VH的下游引物再次扩增VH；使用Linker-r和Linker-s以及所述扩增kappa链的上游引物、带有限制性酶切位点的kappa链下游引物再次扩增kappa链；使用Linker-r和Linker-s以及所述扩增lambda链的上游引物、带有限制性酶切位点的lambda链下游引物再次扩增lambda链；得到第二扩增产物；使用带有限制性酶切位点的连接引物将第二扩增产物中的VH、kappa链和lambda链拼接成scFv基因库；scFv其中，带有限制性酶切位点的VH上游引物Linker引物为：第一带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQIDNO:32所示，具体为：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3’；第二带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQIDNO:33所示，具体为：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG-3’；第三带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQIDNO:34所示，具体为：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’；第四带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQIDNO:35所示，具体为：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3’；第五带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQIDNO:36所示，具体为：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC-3’；第六带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQIDNO:37所示，具体为：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3’；Linker-r序列如SEQIDNO:38所示，具体为：5’-CGATCCGCCACCGCCAGAACCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3’；所述带有限制性酶切位点的kappa链下游引物为：第一带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQIDNO:39所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’；第二带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQIDNO:40所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’；第三带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQIDNO:41所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’；第四带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQIDNO:42所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3’；第五带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQIDNO:43所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’；Linker-s的序列如SEQIDNO:44所示，具体为：5’-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCG-3’；带有限制性酶切位点的lambda链下游引物为：第一带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQIDNO:45所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’；第二带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQIDNO:46所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’；第三带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQIDNO:47所示，具体为：5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；带有限制性酶切位点的连接引物的上游引物序列如SEQIDNO:48所示，具体为：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3’；带有限制性酶切位点的连接引物的下游引物序列如SEQIDNO:49所示，具体为5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGC-3’。(4)使用限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ酶切scFv基因库和使用所述限制性内切酶酶切噬粒载体，连接酶切后的scFv基因库和酶切后的噬粒载体；(5)将步骤(4)的连接产物电转化宿主细胞，得到scFv基因库；(6)培养转入了连接产物的宿主细胞，并得到scFv噬菌体抗体库；(7)靶标噬菌体抗体的筛选和富集。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述限制性内切酶包括：SfiⅠ和NotⅠ。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述噬粒载体为pCANTAB5E载体；所述宿主细胞为大肠杆菌TG1；所述步骤(6)还包括：将辅助噬菌体M13K07加入到转入了连接产物的并生长至对数生长期的大肠杆菌TG1中进行噬菌粒拯救；继续培养8-12小时，离心收集上清即获得scFv噬菌体抗体库。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)还包括分析scFv基因库的多样性和/或计算分析scFv基因库的库容。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)包括：使用靶标抗原包被酶标板，加入scFv噬菌体抗体库进行孵育，随后进行洗板、洗脱；将洗脱下来的scFv噬菌体抗体库进行中和后，再次感染宿主细胞，并进行第二轮的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴兰，黄晓菊，周奇，
申请(专利权)人：上海同进基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31