一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用，利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，克隆dapA基因，构建营养缺陷株互补质粒pMalc2x‑dapA，将所述互补质粒pMalc2x‑dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株中，用同源重组替换pMalc2x载体上氨苄青霉素抗性基因ampR，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统，体外合成sall4氨基端12个氨基酸多肽序列基因，并在N端融合胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB信号肽基因序列，在C端加上His蛋白标签基因序列，一起克隆入互补质粒pMalc2x‑dapA，获得外源药物表达质粒pMalc2x‑dapA‑sall4，将该质粒导入大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，获得的菌株能有效表达sall4多肽，在肝癌治疗上有显著效果。

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及应用。
技术介绍
肝脏是肠癌、乳腺癌、胰腺癌等转移瘤发生的主要部位，肿瘤的转移性扩散，可引起90％癌症死亡，而肝转移瘤由于体积小且数量多，对临床治疗上提出了很大挑战。由于肿瘤部位的微环境发生变化，且免疫屏障受损，加上腐坏的肿瘤中心营养过剩，微生物通常会在此聚集繁殖。虽然人们过去也使用过细菌进行癌症治疗，但都是直接将高浓度细菌注射到血液系统中，此方法缺乏特异性和针对性，且毒副作用大。益生型大肠杆菌Nissle1917具有安全无毒、肿瘤靶向性高的优点，可以作为体内传递外源抗肿瘤药物的优良载体。构建不含抗生素抗性标记基因的质粒平衡系统，导入外源药物表达载体，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌，在体内特异性的表达、传递外源药物达到治疗癌症的目的。期刊《生物工程学报2003.9.19(5)》黄维、曹诚、李平、钟辉、马清钧(通过大肠杆菌thyA染色体-质粒平衡致死系统构建无抗性基因表达载体)一文中介绍了这种方法，但是其菌株基因组除保留必需氨基酸序列外，其余全部敲除。SA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA：利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917的必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA；(2)所述营养缺陷菌株互补质粒的构建及转化：克隆dapA基因，替换pMalc2x的ampR基因，形成营养缺陷株的互补质粒pMalc2x‑dapA；将所述互补质粒pMalc2x‑dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统；(3)在所述质粒平衡系统导入外源药物基因，转化入Niss...

【技术特征摘要】
1.一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA：利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917的必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA；(2)所述营养缺陷菌株互补质粒的构建及转化：克隆dapA基因，替换pMalc2x的ampR基因，形成营养缺陷株的互补质粒pMalc2x-dapA；将所述互补质粒pMalc2x-dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统；(3)在所述质粒平衡系统导入外源药物基因，转化入Nissle1917ΔdapA，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌。2.如权利要求1所述的一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为：a、dapA基因片段的引物设计，所述dapA基因片段含有40bp的拟敲除的dapA基因的上下游同源臂和20bp的卡那霉素抗性基因上下游序列；b、用于一步法敲除dapA基因的PCR片段的扩增；c、转化感受态大肠杆菌Nissle1917；d、...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫华，刘智，陈国忠，任杨柳，
申请(专利权)人：奇元科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42