一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用，利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，克隆dapA基因，构建营养缺陷株互补质粒pMalc2x‑dapA，将所述互补质粒pMalc2x‑dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株中，用同源重组替换pMalc2x载体上氨苄青霉素抗性基因ampR，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统，体外合成sall4氨基端12个氨基酸多肽序列基因，并在N端融合胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB信号肽基因序列，在C端加上His蛋白标签基因序列，一起克隆入互补质粒pMalc2x‑dapA，获得外源药物表达质粒pMalc2x‑dapA‑sall4，将该质粒导入大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA，获得的菌株能有效表达sall4多肽，在肝癌治疗上有显著效果。

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及应用。
技术介绍
肝脏是肠癌、乳腺癌、胰腺癌等转移瘤发生的主要部位，肿瘤的转移性扩散，可引起90％癌症死亡，而肝转移瘤由于体积小且数量多，对临床治疗上提出了很大挑战。由于肿瘤部位的微环境发生变化，且免疫屏障受损，加上腐坏的肿瘤中心营养过剩，微生物通常会在此聚集繁殖。虽然人们过去也使用过细菌进行癌症治疗，但都是直接将高浓度细菌注射到血液系统中，此方法缺乏特异性和针对性，且毒副作用大。益生型大肠杆菌Nissle1917具有安全无毒、肿瘤靶向性高的优点，可以作为体内传递外源抗肿瘤药物的优良载体。构建不含抗生素抗性标记基因的质粒平衡系统，导入外源药物表达载体，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌，在体内特异性的表达、传递外源药物达到治疗癌症的目的。期刊《生物工程学报2003.9.19(5)》黄维、曹诚、李平、钟辉、马清钧(通过大肠杆菌thyA染色体-质粒平衡致死系统构建无抗性基因表达载体)一文中介绍了这种方法，但是其菌株基因组除保留必需氨基酸序列外，其余全部敲除。SALL4为一种癌胚蛋白，在人胚胎肝脏表达，但在成人肝脏中不表达，在肝细胞癌患者和预后恶化患者中，SALL4可在其肝脏中再次表达，SALL4可作为潜在的治疗靶点。SALL4氨基端多肽能够阻断SALL4与核小体重构和组蛋白脱乙酰基酶(NuRD)复合体相互作用，阻断NuRD介导的SALL4再表达。应用SALL412-AA肽能够阻滞SALL4的致癌作用，可用于治疗肝细胞癌。染色体-质粒平衡系统是以营养选择标志基因代替抗性基因的新型质粒载体系统。其宿主菌通常在染色体上带有重要代谢途径的基因突变，因此突变株在基本培养基上不能生长。只有补充相应的外源营养物质或导入携带有野生型基因序列的互补质粒后，才能使其生存。因此在无相应营养物质添加的基本培养基中,互补质粒的导入是缺陷型宿主菌生长的必需条件。目前该系统已广泛应用于不同种属的减毒疫苗的开发研制过程中。CN200310112640.3中介绍了一种非抗性筛选DNA疫苗载体及其构建方法，采用染色体-质粒平衡致死系统代替抗生素抗性基因来作为DNA疫苗扩增的选择性标记，构建新型非抗性筛选DNA疫苗载体，与质粒pVAX1相比，缺失其中的卡那霉素抗性基因，取而代之的是长度为1281bp的鼠伤寒沙门氏菌asd基因，但是在不添加外源物质和无抗生素选择压力下无法保持自身的生理状态，本专利技术在能维持原生型菌种自身生理状态的同时，还提高了菌种应用中的安全性能和高效性，在应用于制备肝癌治疗药品上具有广泛的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，包括以下步骤：(1)构建大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA：利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917的必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA；(2)所述营养缺陷菌株互补质粒的构建及转化：克隆dapA基因，替换pMalc2x载体上的ampR基因，形成营养缺陷株的互补质粒pMalc2x-dapA；将所述互补质粒pMalc2x-dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统；(3)在所述质粒平衡系统导入外源药物基因，转化入Nissle1917ΔdapA，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌。本专利技术敲除dapA基因的原因在于，该基因是二氨基庚二酸(Dap)生物合成途径的必需基因，在细菌中存在，在哺乳动物中不存在，且已经在大肠杆菌中表达，且本专利技术中的宿主菌只需要敲除抗性基因和必需基因，能维持原野生型菌种自身生理状态和肿瘤靶向性；Nissle1917是一种安全和广泛使用的益生菌，本专利技术构建的质粒平衡系统在维持原野生型菌种自身生理状态和肿瘤靶向性的同时，能够在不添加外源营养成分和无抗生素为选择压力的情况下，长时间稳定地维持外源质粒，提高了该菌株在应用中的安全性和高效性的同时，还在一定程度上降低了应用成本。一旦需要结束治疗，只需服用抗生素就能将其从体内清除，还能减少治疗产生的毒副作用。进一步的，所述步骤(1)的具体步骤为：a、dapA基因片段的引物设计，所述dapA基因片段含有40bp的拟敲除的dapA基因的上下游同源臂和20bp的卡那霉素抗性基因上下游序列；b、用于一步法敲除dapA基因的PCR片段的扩增；c、转化感受态大肠杆菌Nissle1917；d、筛选大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA。所述a步骤中引物序列如下，如序列表SEQIDNO.5～6所示的核苷酸序列：DapA-Km-For:TGTTCACGGGAAGTATTGTCGCGATTGTTACTCCGATGGATGTGGGCTGGAGCTGCTTC，DapA-Km-Re:TACAGCAAACCGGCATGCTTAAGCGCCGCTCTGACCGTCTCCTCCTTAGTTCCTATTCC，进一步的，所述步骤(2)的具体步骤为：A、PCR产生无ampR基因的pMalc2xΔampR片段；B、通过PCR合成dapA基因片段；C、通过Gibsoncloning方法连接所述步骤A和步骤B中得到的片段，获得pMalc2x-dapA质粒；D、转化缺陷菌株Nissle1917ΔdapA。所述步骤A中合成dapA的引物序列如下，如序列表SEQIDNO.7～8所示的核苷酸序列：pMl-DapA-For:GCAGGTCGACTCTAGATTACAGCAAACCGGCATGCpMal-DapA-Re:CAAGGACCATAGCATATGTTCACGGGAAGTATTG进一步的，所述步骤(3)的具体步骤为：合成sall4氨基端12个氨基酸多肽序列的基因，并在N端融合胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB基因信号肽基因序列，在C端加上His蛋白标签基因序列，克隆入平衡系统的互补质粒pMalc2x-dapA，获得表达Sall4多肽的质粒pMalc2x-dapA-sall4，然后转化入Nissle1917ΔdapA，获得相应的工程菌。具体的，所述的一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法在制备治疗肿瘤药物上的应用。进一步的，所述肿瘤药物为治疗肝癌的药物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)以益生菌大肠杆菌为研究对象构建基于dapA基因的染色体-质粒平衡系统，并进一步深入开展利用该系统体内表达、传递外源生物活性分子的能力及其对机体安全性的相关研究，达到利用该系统治疗肿瘤疾病的目的。(2)Nissle1917是一种安全和广泛使用的益生菌，本专利技术构建的系统在维持原野生型菌种自身生理状态和肿瘤靶向性的同时，能够在不添加外源营养成分和无抗生素为选择压力的情况下，长时间稳定地维持外源质粒，提高了该菌株在应用中的安全性和高效性的同时，还在一定程度上降低了应用成本。一旦需要结束治疗，只需服用抗生素就能将其从体内清除，还能减少治疗产生的毒副作用。(3)本专利技术中的宿主菌只需要敲除抗性基因和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA：利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917的必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA；(2)所述营养缺陷菌株互补质粒的构建及转化：克隆dapA基因，替换pMalc2x的ampR基因，形成营养缺陷株的互补质粒pMalc2x‑dapA；将所述互补质粒pMalc2x‑dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统；(3)在所述质粒平衡系统导入外源药物基因，转化入Nissle1917ΔdapA，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA：利用同源重组和一步法无缝克隆敲除大肠杆菌Nissle1917的必需基因dapA基因，获得大肠杆菌营养缺陷菌株Nissle1917ΔdapA；(2)所述营养缺陷菌株互补质粒的构建及转化：克隆dapA基因，替换pMalc2x的ampR基因，形成营养缺陷株的互补质粒pMalc2x-dapA；将所述互补质粒pMalc2x-dapA电击转化到所述Nissle1917ΔdapA菌株，获得无抗生素抗性标记的质粒平衡系统；(3)在所述质粒平衡系统导入外源药物基因，转化入Nissle1917ΔdapA，构建可分泌表达外源基因的肿瘤靶向工程菌。2.如权利要求1所述的一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为：a、dapA基因片段的引物设计，所述dapA基因片段含有40bp的拟敲除的dapA基因的上下游同源臂和20bp的卡那霉素抗性基因上下游序列；b、用于一步法敲除dapA基因的PCR片段的扩增；c、转化感受态大肠杆菌Nissle1917；d、...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫华，刘智，陈国忠，任杨柳，
申请(专利权)人：奇元科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42