一种荧光标记的多糖及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种荧光标记的多糖，所述荧光标记的多糖由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构：

Fluorescent labeled polysaccharide and preparation method and use thereof

The present invention discloses a fluorescent labeled polysaccharide which is formed by covalently coupled fluorescent dyes of polysaccharides. The fluorescent dyes have the structure shown in formula I.

【技术实现步骤摘要】
一种荧光标记的多糖及其制备方法和用途
本专利技术属于医学生物检测
，具体涉及一种荧光标记的多糖及其制备方法和用途。
技术介绍
荧光标记技术是指将能发射荧光的物质通过共价结合或物理吸附等方式标记于所研究分子的某个基团上，用它的荧光特性来反映研究对象的信息。利用荧光标记试剂与被研究对象(多糖、核酸、蛋白、多肽等)吸附或共价结合后其荧光特性发生改变，从而反映出有关研究对象性能的信息。随着现代医学、生物学技术的不断发展，新型荧光标记染料的发现以及各种先进荧光检测技术和仪器，如流式细胞仪(FCM)、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等的应用，作为一种非放射性的标记技术，荧光标记具有操作简便、稳定性高、灵敏度高和选择性好等特点，可广泛应用于细胞内外物质检测、组织及活体动物标记成像、药物分析、病理模型研究及疾病早期诊断等，在生物医学研究领域里发挥着重要的作用。多糖是由多个单糖分子脱水聚合，以糖苷键连接而成的糖链。多糖是一种重要的生物高分子，在生物中有储存能量和组成结构的作用。近年来，随着糖化学和糖生物学的不断发展，植物、海洋生物及菌类等各类中药来源的多糖已作为有生物活性的天然产物的一个重要类型出现。大量研究发现中药多糖参与及介导细胞内各种生命活动的调节，具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节，降血糖、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗凝血、抗缺氧、抗衰老等生物活性，且对机体的毒副作用小。因此，多糖的检测对于糖类为基础的药物研究和开发具有重要意义。荧光检测法因其具有灵敏度高、选择性好，动态响应范围宽，能在活体内检测等优点在多糖检测中得以广泛应用。由于多糖本身缺少发光基团和荧光基团，在多糖的荧光检测中，需要将发射荧光的物质连接到多糖的还原性末端，通过检测荧光物质来实现对多糖的定性和定量研究。目前已经商业化的荧光染料有很多，光谱范围分布很广，从蓝色到红色均有覆盖，且能从市场上直接获得。但是，现有的荧光染料也存在很多问题，例如荧光染料的斯托克斯位移一般不超过30nm，荧光染料易淬灭、信号不稳定，且不利于实现不同荧光信号之间的区分，限制了对糖分子的荧光检测。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中荧光标记的多糖存在斯托克位移小、荧光信号不稳定、无法有效区分不同的荧光信号的缺陷。为此，本专利技术提供了一种荧光标记的单糖，所述荧光标记的多糖由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构：其中，X为卤素；R1选自氢、烷基、环烷基、芳基和杂环基的一种。可选地，上述的荧光标记的多糖，所述多糖经溴化氰活化，在所述多糖的羟基位置上连接氰基，所述氰基连接所述荧光染料的氨基。可选地，上述的荧光标记的多糖，所述X为Br。可选地，上述的荧光标记的多糖，所述荧光染料具有式A～式G所示的结构：可选地，上述的荧光标记的多糖，所述多糖选自葡聚糖、壳聚糖、果胶多糖、灰树花多糖、灵芝多糖、香菇多糖和藻多糖中的至少一种。本专利技术提供了一种制备上述荧光标记的多糖的方法，包括如下步骤：(1)将多糖溶解于水中后，加入饱和溴化氰溶液反应，反应3-20分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化处理；(2)将步骤(2)中得到的纯化的溶液浓缩至干，用0.1-0.3M的硼砂溶液溶解，加入式I所示的荧光染料，避光反应后得到荧光标记的多糖。可选地，上述的制备方法，所述步骤(1)中，所述反应在pH>10的条件下进行；和/或，反应时间控制5-10分钟。可选地，上述的制备方法，所述步骤(2)中，所述硼砂溶液的浓度为约0.2M，所述硼砂溶液的用量与所述多糖的用量(mL:mg)为(0.1～1)：1。可选地，上述的制备方法，所述式I所示的荧光染料通过如下步骤制备：(1)中间体I’-1制备将苯肼加入冰乙酸中，搅拌，缓慢滴加3-甲基-2-丁酮，滴加完毕后加热至60-65℃，反应3-4小时，萃取，浓缩，精制，得到中间体I’-1；其中，苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1：(1.0-1.2)；(2)中间体I’-2制备将中间体I’-1和1,2-二溴乙烯加入甲苯中，氮气保护，加热回流反应16-18小时，冷却，析出固体，即中间体I’-2；其中，中间体I’-1和1,2-二溴乙烯的摩尔比为1：(1.5-2.0)；(3)中间体I’-4制备将干燥的N，N-二甲基甲酰胺加到干燥的二氯甲烷中，冰浴下加入三氯氧磷的二氯甲烷溶液，搅拌，加入环己酮，撤去冰浴，加热回流反应2-3小时，将反应液倒入碎冰中，静置过夜，析出固体，即中间体I’-4；其中，环己酮、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔比为1：(1.0-1.1)：(1.0-1.05)；(6)中间体I’-5制备将中间体I’-2和中间体I’-4加至正丁醇和甲苯的混合液中，加热回流2-3小时，析出固体，过滤得到中间体I’-5；(7)化合物I制备将中间体I’-5与Br-R1-NH2发生氨基取代反应，反应过程中加入NaOH，生产化合物I；合成路线如下所示：本专利技术提供了上述的荧光标记的多糖在制备荧光探针中的用途。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的一种荧光标记的单糖，由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构。荧光标记的多糖在血清等检测环境中的稳定性高，同时荧光标记的多糖生物相容性高、毒性低，可广泛应用于细胞内外、组织及活体动物的多糖检测，在多糖吸收、代谢排泄检测及药理研究等领域具有重要意义。由于式I所示的荧光染料具有大的斯托克斯位移，荧光染料分子的发射波长与激发波长进一步分开，使荧光标记的多糖在用于荧光检测时具有荧光稳定性好、荧光量子产率高，以及成像结果信噪比高的优点。另外，长的斯托克斯位有利于增加不同荧光染料分子之间的区分度，适于多重荧光检测，因此，有利于实现不同荧光标记的多类多糖分子的检测。另外，本专利技术提供的荧光标记的多糖，适于作为液相芯片探针用于生物体内外糖类分子的检测，增加了液相芯片的检测对象和荧光标记的探针种类。2.本专利技术提供的荧光标记的多糖的制备方法，合成所需的原料易得，反应条件温和，操作简单，反应的选择性高，反应制备的荧光标记的多糖兼具高的荧光产率、荧光稳定性和生物活性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是实施例1中的化合物B的1H核磁谱图；图2是本专利技术实验例2中制备的荧光标记的葡聚糖在不同浓度下对HEK-293T细胞的细胞生存率影响检测柱状图；图3是本专利技术实验例3中制备的荧光标记的壳聚糖在不同浓度下对HEK-293T细胞的细胞生存率影响检测柱状图；图4是本专利技术实验例2中制备的荧光标记的葡聚糖在PBS或血清中孵育不同时间的化学纯度图；图5是本专利技术实验例3中制备的荧光标记的壳聚糖在PBS或血清中孵育不同时间的化学纯度图；图6是荧光标记的多糖在HEK-293T细胞中的荧光强度检测结果。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光标记的单糖，其特征在于，所述荧光标记的多糖由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构：

【技术特征摘要】
1.一种荧光标记的单糖，其特征在于，所述荧光标记的多糖由多糖共价偶联荧光染料形成，所述荧光染料具有式I所示的结构：其中，X为卤素；R1选自氢、烷基、环烷基、芳基和杂环基的一种。2.根据权利要求1所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述多糖经溴化氰活化，在所述多糖的羟基位置上连接氰基，所述氰基连接所述荧光染料的氨基。3.根据权利要求1或2所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述X为Br。4.根据权利要求1-3任一项所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述荧光染料具有式A～式G所示的结构：5.根据权利要求1-4任一项所述的荧光标记的多糖，其特征在于，所述多糖选自葡聚糖、壳聚糖、果胶多糖、灰树花多糖、灵芝多糖、香菇多糖和藻多糖中的至少一种。6.一种制备权利要求1-5任一项所述的荧光标记的多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将多糖溶解于水中后，加入饱和溴化氰溶液反应，反应3-20分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化处理；(2)将步骤(2)中得到的纯化的溶液浓缩至干，用0.1-0.3M的硼砂溶液溶解，加入式I所示的荧光染料，避光反应后得到荧光标记的多糖。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应在pH>10的条件下进行；和/或，反应时间控制5-10分钟。8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述硼砂溶液的浓度为约0.2M，所述硼砂溶液的用量与所述多...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，兰州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32