一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法，该弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条包括：吸水垫、硝酸纤维素膜、纳米胶体碳释放垫、样品垫、PVC胶板；该弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法包括：弓形虫抗原ESA的制备、兔抗ESA血清的制备、纯化兔抗ESA抗体、确定纳米胶体碳ESA溶液的最佳PH值及ESA的用量、纳米胶体碳母液的制备、纳米胶体碳溶液最佳稀释倍数的确定、试纸条的组装，本研究建立的弓形虫病胶体碳诊断试纸条灵敏度和特异性较好，具有操作简单、快速，检测条带清晰，相对于传统的胶体金诊断试纸条制作成本极大降低的优点，适用于临床弓形虫病的快速诊断。

Diagnostic test strip for Toxoplasma gondii nano colloid carbon and preparation method thereof

The invention discloses a Toxoplasma gondii nano-colloidal carbon diagnostic test strip and a preparation method thereof. The Toxoplasma gondii nano-colloidal carbon diagnostic test strip comprises a water-absorbing pad, a nitrocellulose membrane, a nano-colloidal carbon release pad, a sample pad and a PVC rubber plate. The preparation method of the Toxoplasma gondii nano-colloidal carbon diagnostic test strip includes: Toxoplasma anti Preparation of A, preparation of rabbit anti-ESA serum, purification of rabbit anti-ESA antibody, determination of the optimum pH value and dosage of nano-colloidal carbon ESA solution, preparation of nano-colloidal carbon mother solution, determination of the optimum dilution multiple of nano-colloidal carbon solution, assembly of test strips, sensitivity and specificity of the colloidal carbon diagnostic test strip for toxoplasmosis were established. Compared with the traditional colloidal gold diagnostic strip, it has the advantages of good specificity, simple operation, rapid detection, clear detection strip, and greatly reduced the cost of making colloidal gold diagnostic strip.

【技术实现步骤摘要】
一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法
本专利技术属于弓形虫病检测
，涉及一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法。
技术介绍
弓形虫可以感染几乎所有的温血动物，给养殖业带来重大的经济损失，同时感染弓形虫的孕妇会导致流产、胎儿畸形、先天性缺陷或死胎。目前弓形虫病的血清学诊断方法主要有改良凝集实验(MAT)、间接血凝实验(IHA)、间接免疫荧光实验(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等，但是这些方法有的需要具有专业知识的技术人员在实验室条件下才能操作完成，费时费力；有的制作成本较高不利于大面积推广。纳米胶体碳克服了上述缺陷，可以有效的作为快速诊断试纸条的标记物质，且成本非常低。弓形虫排泄分泌抗原(ESA)主要包括微线体蛋白(MIC)、棒状体蛋白(ROP)及致密颗粒蛋白，具有很好的免疫原性和反应原性。基于纳米碳颗粒作为标记物而出现的纳米胶体碳试纸条相对传统的金标胶体试纸条检测背景更为清晰，且纳米碳颗粒的成本是金标颗粒的万分之一，这极大的降低了试纸条研制的成本，目前基于该标记物而研制的试纸条已成功应用于日本血吸虫和疟原虫的检测。本研究采用纳米碳做显色标记物，弓形虫ESA作为检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条包括质控线(1)、检测线(2)、吸水垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、纳米胶体碳释放垫(5)、样品垫(6)、PVC胶板(7)，其特征在于，所述质控线(1)是将抗ESA IgG喷于硝酸纤维素膜(4)形成，所述检测线(2)是将纯化ESA喷于硝酸纤维素膜(4)形成，检测线(2)和质控线(1)设置在硝酸纤维素膜(4)的两侧，硝酸纤维素膜(4)的上方两端分别为纳米胶体碳释放垫(5)和吸水垫(3)，纳米胶体碳释放垫(5)的上方为样品垫(6)，所述样品垫(6)、纳米胶体碳释放垫(5)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(3)从左至右依次排列并粘贴在PVC胶板(7)上。

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条包括质控线(1)、检测线(2)、吸水垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、纳米胶体碳释放垫(5)、样品垫(6)、PVC胶板(7)，其特征在于，所述质控线(1)是将抗ESAIgG喷于硝酸纤维素膜(4)形成，所述检测线(2)是将纯化ESA喷于硝酸纤维素膜(4)形成，检测线(2)和质控线(1)设置在硝酸纤维素膜(4)的两侧，硝酸纤维素膜(4)的上方两端分别为纳米胶体碳释放垫(5)和吸水垫(3)，纳米胶体碳释放垫(5)的上方为样品垫(6)，所述样品垫(6)、纳米胶体碳释放垫(5)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(3)从左至右依次排列并粘贴在PVC胶板(7)上。2.根据权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条，其特征在于，所述样品垫(6)为玻璃纤维素膜。3.根据权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条，其特征在于，所述纳米胶体碳释放垫(5)为胶体碳溶液处理好的聚酯膜。4.根据权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条，其特征在于，所述吸水垫(3)和硝酸纤维素膜(4)相接处重叠1.0-1.5mm，纳米胶体碳释放垫(5)与硝酸纤维素膜(4)相接处重叠1.0-1.5mm，所述样品垫(6)与纳米胶体碳释放垫(5)相接处重叠1.0-1.5mm。5.如权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法，其特征在于，该弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法具体包括以下步骤：步骤一、弓形虫抗原ESA的制备：从液氮中保存的弓形虫速殖子，放入到37℃水浴锅中解冻，大约5min融化后，用5mL灭菌生理盐水加入到融化后的1mL弓形虫速殖子保存液中，反复吹打混匀后5000rpm/min离心10min，离心后弃上清液，沉淀再加5mL的灭菌生理盐水充分混匀后以同样的速度离心，反复洗涤2～3次，最后用混有1000U抗生素的溶液洗涤管底，按每只小鼠0.2mL的剂量注入小鼠腹腔中，连续传代3次恢复虫株活性和毒力后，待小鼠发病时，用2mL灭菌生理盐水冲洗感染鼠的腹腔，收集腹腔洗液，3000rpm/min离心30min，收集上清镜检确定没有速殖子和小鼠腹腔细胞后冻于-20℃冰箱过夜，次日取冻存上清室温融化，3000rpm/min离心30min除去自凝物，收集上清即为ESA抗原；经2.0荧光定量仪测定弓形虫抗原ESA蛋白浓度为1.56mg/mL，取50μLESA加入10μL5XLoadingbuffer充分混匀后于沸水中煮5-10min，然后将样品加入到聚丙烯酰胺凝胶的梳子孔内上样，进行SDS-PAGE电泳确定纯化的ESA结果；步骤二、兔抗ESA血清的制备：以纯化后的弓形虫ESA为抗原，免疫SPF新西兰大白兔，取纯化的ESA抗原0.5mL用生理盐水稀释，加入等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后，在家兔腿部肌肉、背部皮下进行注射，于第一次免疫后间隔2周再以0.5mLESA抗原加入等体积不完全弗氏佐剂充分乳化后在家兔背部、腿部皮下及肌肉进行注射，再间隔2周用与第二次相同的方法进行第三次免疫，采血测其效价，未达到要求，直接取0.5mLESA抗原用生理盐水稀释后注射进行加强免疫，最后在加强免疫后第10天采用心脏采血的方法采集血液，将采集的兔血放于37℃恒温箱中放置1h后4000rpm/min离心收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱兴全，宋海洋，邹丰才，王萌，王金磊，李朝，杨建发，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，云南农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62