具有催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了具有催化DHAP或D‑G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用。本发明专利技术提供了蛋白质，是如下1)或2)：1)序列表中序列1所示的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术发现一个新蛋白CeasA，可以用来催化DHAP或D‑G3P生成丙烯酸，有望实现生物法绿色生产丙烯酸。

An enzyme that catalyzes the synthesis of acrylic acid by DHAP or D-G3P and its application

The invention discloses an enzyme which catalyzes the synthesis of acrylic acid by DHAP or D G3P and its application. The present invention provides proteins as follows: 1) proteins shown in sequence 1 in sequence list; 2) proteins derived from sequence 1 by substituting and/or deleting and/or adding the amino acid sequence shown in sequence 1 through one or more amino acid residues. The experiment of the invention shows that a new protein CeasA can be used to catalyze the formation of acrylic acid from DHAP or D_G3P, and it is hopeful to realize the green production of acrylic acid by biological method.

【技术实现步骤摘要】
具有催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用
本专利技术属于生物
，涉及具有催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用。
技术介绍
丙烯酸(Acrylicacid)，化学式为C3H4O2，是无色透明、味苦辣、带有刺激性气味的腐蚀性液体，能溶于水、乙醇及乙醚等，不耐光及热，有自聚性。丙烯酸是重要的有机化工原料,大部分用于生产丙烯酸酯(如丙烯酸甲酯、乙酯、丁酯及辛酯等),少量用于生产高吸水性树脂、助洗涤剂和水处理剂等。丙烯酸及其酯系列产品可广泛应用于涂料、化纤、纺织、皮革、塑料、粘和剂、石油开采等各个领域。丙烯酸主要采用化学方法生产。丙烯酸在20世纪30年代实现工业化生产。其生产历程经历了几个阶段：氯乙醇法、氰乙醇法、高压Reppe法、烯酮法、丙烯腈水解法和丙烯氧化法。前面几种工艺因技术和经济原因已经基本被淘汰。现在采用的丙烯氧化法是20世纪60年代发展起来的方法。所谓丙烯两步氧化法是在复合金属氧化物催化剂存在下,经空气氧化先生成丙烯醛,再进一步催化氧化成丙烯酸。丙烯酸及其酯是现代有机化工中重要的基础原料和高分子单体，在精细化工的应用中占有相当重要的地位。尽管丙烯氧化法具有工艺先进、原料价格低廉、效率高等优点，发展迅速，在丙烯酸及其酯的生产中占据主导地位。然而，目前丙烯酸的生产原料归根结底还是来源于石油，其生产能耗高，污染较严重，加上石油资源日益匮乏，导致原料价格攀升，生产成本必然增加，因此可再生的生物基丙烯酸替代石油基丙烯酸是大势所趋。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，是如下1)或2)：1)序列表中序列1所示的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。例如：在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。编码上述蛋白质的DNA分子也是本专利技术保护的范围。上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。上述2)中严格条件是指：(1)在较低的离子强度和较高的温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，优选为在97％以上时才发生杂交；并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与序列1所示的成熟多肽具有相同的生物学活性和功能。上述3)中限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化DHAP或D-G3P缩合合成丙烯酸功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述1)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。进一步地，上述核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以单链的或者是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术保护的范围。或，扩增上述核酸分子全长或其任意片段的引物对也是本专利技术保护的范围。上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化DHAP(磷酸二羟基丙酮)或D-G3P(D-3-磷酸甘油醛)合成丙烯酸产品中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术另一个目的是提供一种催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸的产品。本专利技术提供的产品，包括上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。上述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本专利技术中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。优选地，所述重组载体为在pET-28a载体的多克隆位点，插入序列表中序列3所示的核苷酸。可选的，克隆位点为NdeI酶切位点和XhoI酶切位点。上述重组菌包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选地为大肠杆菌、酵母。上述产品中，所述产品为试剂盒；或所述产品包括TPP和MgSO4。本专利技术第3个目的是提供一种催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：以DHAP或D-G3P为底物，用上述蛋白催化合成丙烯酸。上述方法中，所述催化反应的条件为25℃-37℃反应20h；或所述催化反应的条件为30℃反应20h。上述方法中，所述催化反应所需的pH值为7.4-8.2；或所述催化反应的所需的pH值为8.2；或所述催化所需的反应体系包括TPP和MgSO4。上述反应体系(200μL)如下：5mMDHAP或D-G3P，2mMTPP(焦磷酸硫胺素)，6mMMgSO4、1mg/ml上述纯化的CeasA蛋白和蛋白缓冲液(50mMTris-HCl，2mMEDTA，0.1％TritonX-100，pH8.2)混匀，得到反应体系。本专利技术的实验证明，本专利技术发现一个新蛋白CeasA，可以用来催化DHAP或D-G3P生成丙烯酸，有望实现生物法绿色生产丙烯酸。附图说明图1为重组质粒pET-28a-ceasA的质粒图谱示意图。图2为CeasA纯化SDS-PAGE示意图。图3为丙烯酸标准品LC-MS分析的色谱图。图4为对照样品产物LC-MS分析的色谱图。图5为CeasA催化D-G3P产物LC-MS分析的色谱图。图6为丙烯酸标准品HPLC分析的色谱图。图7为CeasA催化DHAP产物HPLC分析的色谱图。图8为CeasA催化D-G3P产物LC-MS分析的质谱图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。在下面的实施例中进一步说明本专利技术，但并不限制本专利技术的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。实施例1、CeasA蛋白的获得1、ceasA基因获得在Nocardiasp.BMG51109中发现ceasA基因，其核苷酸序列为序列1，该基因编码的蛋白为Cea本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列1所示的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列1所示的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是如下1)-3)中任一种的核酸分子：1)编码区为序列表中序列3所示的核酸分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的核酸分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的核酸分子。4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。或，扩增权利要求2或3所述核酸分子全长或其任意片段的引物对。5.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细...

【专利技术属性】
技术研发人员：江会锋，徐占梅，刘玉万，燕志慧，卢丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12