一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5；所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；本发明专利技术通过大量复杂实验筛选并验证了所述单克隆抗体能特异性结合贝伐珠单抗，同时不影响贝伐珠单抗与VEGF的结合，能够监测评估贝伐珠单抗的代谢过程，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A monoclonal antibody for identification of bevacizumab and its application

The invention provides a monoclonal antibody for recognizing bevacizumab and its application. The amino acid sequence of the light chain CDR1 of the monoclonal antibody is SEQ ID NO.3, the amino acid sequence of the light chain CDR2 is SEQ ID NO.4, the amino acid sequence of the light chain CDR 3 is SEQ ID NO.5, and the amino acid sequence of the heavy chain CDR1 of the monoclonal antibody is S ID NO.5. EQ ID NO.6, the amino acid sequence of heavy chain CDR2 is SEQ ID NO.7, and the amino acid sequence of heavy chain CDR3 is SEQ ID NO.8. The present invention has screened and verified that the monoclonal antibody can specifically bind to bevacizumab through a large number of complex experiments, and does not affect the binding of bevacizumab to VEGF, and can monitor and evaluate bevacizumab. The metabolic process has broad application prospects and huge market value.

【技术实现步骤摘要】
一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
近年来，抗体药物以其安全有效、特异性高等优点被广泛应用于肿瘤、移植排异、感染性疾病、自身免疫疾病等多种疾病的临床治疗。抗体药物的药物代谢是临床前和临床试验研究中的重要检测指标。贝伐珠单抗是一种以血管内皮生长因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）为特异性靶点的重组人源化IgG1型单克隆抗体，它能特异性结合VEGF，阻断VEGF与VEGF受体1和2的结合及信号传导，抑制VEGF的生物学活性，使血管生成受阻，从而无法提供肿瘤组织生长所需的氧和其他营养，发挥抗癌作用，贝伐珠单抗可用于治疗转移型结肠直肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等。由于贝伐珠单抗的靶点VEGF是可溶性蛋白，其研发机构在该药物的药物代谢（Pharmacokinetics，PK）研究中使用了一种检测血清总药物浓度的方法，该方法不区分游离的药物和与靶点VEGF结合的药物（详见贝伐珠单抗产品说明），因此要求检测用试剂能同时识别游离的贝伐珠单抗和已与VEGF结合的贝伐珠单抗。安维汀（Avastin，基因泰克公司）说明书中关于PK检测的叙述明确表明检测血液中药物浓度时，应包括游离的药物和已结合配体的药物。而国内常用的检测手段，主要采用抗原VEGF包板检测，不能检测到已和VEGF结合的贝伐珠单抗，无法同时检测游离的药物和已结合配体的药物，因此，在临床检测中无法反映出生物样本中全部的药物含量。综上所述，研发一种有效检测血液中贝伐珠单抗浓度的单克隆抗体，能同时检测游离药物和已结合配体的药物，在临床前和临床试验检测贝伐珠单抗的血药浓度的，为临床试验的生物分析提供有力的工具，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体能够结合抗贝伐珠单抗，作为监测评估药物代谢过程的工具，在临床分析贝伐珠单抗的药物代谢方面发挥重要作用。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列为SEQIDNO.3，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQIDNO.4，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQIDNO.5；所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQIDNO.6，重链CDR2的氨基酸序列为SEQIDNO.7，重链CDR3的氨基酸序列为SEQIDNO.8。所述单克隆抗体Fab段的轻链氨基酸序列为SEQIDNO.1，所述单克隆抗体Fab段的重链氨基酸序列为SEQIDNO.2。所述SEQIDNO.1如下所示：DIVLTQTPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK.所述SEQIDNO.2如下所示：EIEVKLEESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSNYWNWIRKFPGNKLEYMGYINYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYFLQLNSVTTEDTATYYCARWTTVVSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYNRRP.所述SEQIDNO.3如下所示：KSVSTSGYSYMH.所述SEQIDNO.4如下所示：YLVSNLES.所述SEQIDNO.5如下所示：NIHPVEEEDA.所述SEQIDNO.6如下所示：TCSVTGDSITSNYWN.所述SEQIDNO.7如下所示：MGYINYSGSTYYNPSLKS.所述SEQIDNO.8如下所示：VTTEDTATYYCARWTTVVSM.本专利技术中，专利技术人通过深入研究现有技术中对于贝伐珠单抗的药物浓度检测的优缺点，通过设计大量复杂实验，反复筛选并最终发现了上述单克隆抗体，验证了该抗体能特异性识别贝伐珠单抗，同时不影响贝伐珠单抗与VEGF的结合，药物代谢是临床上评测药物在体内作用的重要手段，对给药方式和剂量有重要的参考作用，因此准确的检测出抗体药物浓度关乎临床用药的效果，本专利技术提供的特异结合抗贝伐珠单抗的抗体，可以作为监测评估贝伐珠单抗药物代谢过程的工具，在临床分析贝伐珠单抗的药物代谢方面发挥重要作用。本专利技术提供的单克隆抗体命名为5A9，是以贝伐珠单抗作为免疫原，利用单克隆抗体技术制备获得的特异性抗贝伐珠单抗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的序列跟已有序列均不同，具有新颖性和创造性。所述贝伐珠单抗包括安维汀（Avastin）及其生物类似药。第二方面，本专利技术提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌第一方面所述的单克隆抗体。第三方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的单克隆抗体或第二方面所述的杂交瘤细胞用于制备评估贝伐珠单抗代谢过程的药物和/或试剂盒的用途。第四方面，本专利技术提供一种制备如第一方面所述单克隆抗体的方法，包括如下步骤：（1）动物免疫；（2）细胞融合；（3）杂交瘤细胞的筛选；（4）杂交瘤细胞的克隆化；（5）单克隆抗体的制备。作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述单克隆抗体的方法，具体包括如下步骤：（1）动物免疫：采用6周龄BALB/C雌鼠，抗原为商品化的贝伐珠单抗Avastin，免疫途径为皮下注射；（2）细胞融合：制备脾细胞悬液、骨髓瘤细胞悬液和饲养层细胞，采用PEG介导融合法进行融合；（3）杂交瘤细胞的筛选：常规间接ELISA方法筛选步骤（2）得到的融合细胞的阳性孔；（4）杂交瘤细胞的克隆化：将步骤（3）筛选出的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株5A9细胞；（5）单克隆抗体的制备：将步骤（4）得到的5A9细胞扩大培养，注射小鼠腹腔，收集腹水离心取上清，纯化得到所述单克隆抗体。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的单克隆抗体能特异性识别Avastin，与其他IgG1型抗体无交叉反应，不阻断贝伐珠单抗与VEGF的结合，没有中和能力，能够监测评估贝伐珠单抗的代谢过程，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。附图说明图1为本专利技术的单克隆抗体5A9与贝伐珠单抗Avastin的结合特异性结果图；图2为本专利技术的单克隆抗体5A9对Avastin的中和活性结果图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但本专利技术并非局限在实施例范围内。实施例1单克隆抗体5A9的制备过程本实施例的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、杂交瘤细胞的克隆化和单抗的制备等。（1）动物免疫：采用6周龄BALB/C雌鼠，抗原为商品化的贝伐珠单抗安维汀，采用常规免疫法，免疫途径为皮下注射，用50μgAvastin与福氏完全佐剂等体积混合，于小鼠背部皮下分3到4点注射；经两周后进行二次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂；两周后进行三次免疫，用福氏不完全佐剂；两周后加强免疫，用福氏不完全佐剂；3天后取脾细胞进行融合；（2）细胞融合：最后一次免疫后第三天制备；脾细胞悬液的制备：于细胞融合当天制备，取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5；所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。

【技术特征摘要】
1.一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列为SEQIDNO.3，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQIDNO.4，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQIDNO.5；所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQIDNO.6，重链CDR2的氨基酸序列为SEQIDNO.7，重链CDR3的氨基酸序列为SEQIDNO.8。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵喆，刘聪，刘钰山，黄应峰，
申请(专利权)人：宝船生物医药科技上海有限公司，白帆生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31