本发明专利技术公开了一种PIMT表达质粒、扩增引物、构建方法及应用。所述PIMT表达质粒的序列如SEQ ID NO:1所示。所述PIMT表达质粒的构建方法包括：根据人源PCMT、mRNA和pcDNA3.1(‑)‑Flag‑GFP质粒提供的酶切位点，进行酶切位点选择，所述PCMT的酶切位点包括XhoI和BamHI，获得PIMT表达质粒。用于PIMT表达质粒的扩增引物的序列分别如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:7所示。本发明专利技术通过基因技术构建了PIMT表达质粒，可使PIMT在RA‑FLS中的表达量提高，检测量提高，可作为药物用于调控RA‑FLS的凋亡和增殖，实现对类风湿性关节炎的治疗。
PIMT expression plasmid, amplification primer, construction method and Application
The invention discloses a PIMT expression plasmid, an amplification primer, a construction method and an application. The sequence of the PIMT expression plasmid is shown as SEQ ID NO:1. The construction method of the PIMT expression plasmid includes: selecting the digestion site according to the digestion site provided by the human PCMT, mRNA and pcDNA3.1 GFP plasmid, and obtaining the PIMT expression plasmid according to the dig The sequences of amplified primers used for PIMT expression plasmids are shown in SEQ ID NO:2 ~ SEQ ID NO:7, respectively. The invention constructs the PIMT expression plasmid by gene technology, which can increase the expression of PIMT in RA_FLS and the detection quantity. It can be used as a drug to regulate the apoptosis and proliferation of RA_FLS and realize the treatment of rheumatoid arthritis.
【技术实现步骤摘要】
一种PIMT表达质粒、扩增引物、构建方法及应用
本专利技术涉及一种PIMT(蛋白异天冬氨酰甲基转移酶，proteinisoaspartyl-methyltransferase,简称PIMT)表达质粒，具体涉及一种PIMT表达质粒的构建方法及所用扩增引物，以及其在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用，属于基因工程
技术介绍
生理条件下，蛋白质中的L-天冬酰胺酰残基(L-asparaginylresidues)和L-天冬氨酰残基(L-aspartylresidues)会自发的脱氨酰或异构化形成异常的L-天冬氨酰(abnormall-isoaspartylresidues，L-isoAsp)，这种异常的L-isoAsp在蛋白内集聚能改变蛋白质的结构并影响蛋白质功能。蛋白异天冬氨酰甲基转移酶(proteinisoaspartyl-methyltransferase,PIMT)是普遍存在于原核细胞与真核细胞中的修复酶，在生理条件下能识别并转移S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，AdoMet)中甲基基团至异常的L-天冬氨酰(L-isoaspartyl)残基中的游离羧基上，修复异常的L-天冬氨酰残基转变成正常的L-天冬氨酰，并恢复蛋白质的结构和功能。体外研究发现，衰老的钙调蛋白不能激活蛋白激酶的原因是L-天冬氨酰残基通过自发的脱氨酰作用转变成为异常的L-天冬氨酰，与PIMT酶共孵育后，钙调蛋白的激活作用恢复。衰老的表皮生长因子、细菌荧光载体蛋白、阿尔茨海默尔-淀粉样蛋白、朊病毒蛋白和组织型纤溶酶原激活物等蛋白质中均被证实有异常的L-isoAsp集聚和蛋白功能的改变，与PIMT酶共孵育后，蛋白质的功能恢复。以上研究显示，PIMT能识别并修复蛋白质肽链中异常L-isoAsp残基，这种识别修复作用能影响蛋白质的功能。人PIMT基因由蛋白羧基邻甲基转移酶1(proteincarboxyl-O-methyltransferase-1，PCMT-1；EC2.1.1.77)基因编码。人PIMT基因位于人染色体6q22.3～6q24上，全长1751bp，包含8个外显子。人PIMT是由226个氨基酸组成的分子量为24500Da的单体酶，其序列高度保守，含有三个S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)识别区域，分别位于81～89，150～157和171～181位氨基酸上，N末端含有能被乙酰化修饰的丙氨酸。人PIMT有两种亚型，PIMT-Ⅰ和PIMT-Ⅱ，二者的结构略有不同，但具有相似的底物特异性，对于位于细胞内的底物，具有相同的催化作用。PIMT基因缺失具有诱导细胞过度增殖和细胞凋亡的作用，研究发现，与正常的小鼠相比较，敲除PIMT基因的小鼠其CD4+T淋巴细胞和脾细胞过度增殖，而将这种小鼠的骨髓移植给正常小鼠，会产生抗DNA抗体和表现典型红斑狼疮肾炎的病理变化。而在肿瘤细胞中PIMT基因的缺失也能引起细胞增殖。进一步的研究显示PIMT修复异常L-isoAsp残基功能对于维持正常的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号传导系统十分重要，用SiRNA抑制PIMT基因在HEK-293细胞系中表达，会导致异常L-isoAsp残基集聚，而用表皮生长因子刺激HEK-293细胞，Raf-1、MEK1/2(mitogen-activatedproteinkinase)和细胞外调节激酶(extracellularregulatingkinase，ERK)1/2这三个MAPK信号系统级联分子都呈现高度磷酸化，而高磷酸化Raf-1,MEK1/2和ERK1/2均能引起细胞增殖。以上研究结果提示：PIMT基因缺失引起细胞增殖可能是通过MAPK信号转导通路起作用的。有研究发现，在小鼠皮质神经元细胞和COS1细胞系中，PIMT能够保护细胞抵御Bax诱导的凋亡，PIMT这种抗凋亡作用依赖其腺苷甲硫氨酸结合区域，而这个区域是在所有的甲基转移酶中是高度保守的。将重组PIMT转染至内皮细胞中，能抑制由氧化应激诱导的凋亡，且PIMT的保护作用是通过其甲基转移酶的功能，而不是其非酶修饰功能；进一步研究显示PIMT保护细胞凋亡时的作用底物包括热休克蛋白70，热休克蛋白90，肌动蛋白Actin和Bcl-xL。以上研究显示：PIMT通过其甲基转移酶的功能保护细胞抵御凋亡。但是，目前尚未有任何关于将PIMT表达质粒进行重组构建，用于类风湿性关节炎的治疗方面的报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种PIMT表达质粒，具体涉及一种PIMT表达质粒的构建方法及所用扩增引物，以及其在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种PIMT表达质粒，其序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术实施例还提供了一种携带有前述的PIMT表达质粒的重组表达载体。本专利技术实施例还提供了一种转化或转染有前述重组表达载体的宿主菌。本专利技术实施例还提供了前述PIMT表达质粒的构建方法，其包括：根据人源PCMT、mRNA和pcDNA3.1(-)-Flag-GFP质粒提供的酶切位点，进行酶切位点选择，其中，所述PCMT的酶切位点包括XhoI和BamHI，获得重组的PIMT表达质粒。本专利技术实施例还提供了一种用于前述PIMT表达质粒的扩增引物，所述扩增引物的序列分别如SEQIDNO:2～SEQIDNO:7所示。本专利技术实施例还提供了由前述PIMT表达质粒扩增得到的表达蛋白。本专利技术实施例还提供了前述的PIMT表达质粒或表达蛋白在调控类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)滑膜成纤维样细胞(fibroblast-likesynoviocytes，FLS)的凋亡和增殖中的应用。进一步地，本专利技术实施例还提供了前述的PIMT表达质粒或表达蛋白在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少在于：本专利技术通过基因技术构建了重组的PIMT表达质粒，可使PIMT在RA-FLS中的表达量提高，检测量提高，有效调控RA-FLS增殖，提高RA-FLS细胞的抗侵袭能力，同时，本专利技术构建的重组PIMT表达质粒是建立荧光定量PCR检测PIMTmRNA的基础，也是进一步研究类风湿性关节炎的基础；并且，本专利技术构建的PIMT表达质粒和表达蛋白可作为药物，用于调控RA-FLS的凋亡和增殖，实现对类风湿性关节炎的治疗，应用前景广泛。附图说明图1是本专利技术一典型实施方案中pcDNA3_1-多克隆位点示意图。图2是本专利技术一典型实施方案中pcDNA3_1载体示意图。图3a-图3b分别是本专利技术一典型实施方案中PIMT在RA患者关节滑膜组织中的表达情况示意图。具体实施方式如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案，其主要是通过基因技术构建一种重组的PIMT表达质粒，并用于载药治疗类风湿性关节炎的技术方法，其原理在于PIMT能够保护细胞抵御Bax诱导的凋亡，PIMT这种抗凋亡作用依赖其腺苷甲硫氨酸结合区域。本专利技术实施例的一个方面提供的一种PIMT表达质粒，其序列如SEQIDN本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PIMT表达质粒，其特征在于，它的序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种PIMT表达质粒，其特征在于，它的序列如SEQIDNO:1所示。2.携带有权利要求1所述的PIMT表达质粒的重组表达载体。3.转化或转染有权利要求2所述重组表达载体的宿主菌。4.如权利要求1所述PIMT表达质粒的构建方法，其特征在于包括：根据人源PCMT、mRNA和pcDNA3.1(-)-Flag-GFP质粒提供的酶切位点，进行酶切位点选择，其中，所述PCMT的酶切位点包括XhoI和BamHI，获得重组的PIMT表达质粒。5.一种用于权利要求1所述PIMT表达质粒的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的序列分别如SEQIDNO:2～SEQIDNO:7所示。6.根据权利要求5所述的用于PIMT表达质粒的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中，所述第一引物组中用于XhoI位点的上游引物的序列如SEQIDNO:2所示，用于BamHI位点的下游引物的...
【专利技术属性】
技术研发人员：周洁，陆英，张慧，杨曹骅，
申请(专利权)人：江苏天瑞精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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