基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件及表达载体和应用制造技术

本发明专利技术涉及基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件及表达载体及其应用，所述基因元件Sk与2A裂解肽组成；所述2A裂解肽为家蚕质型多角体病毒的2A；所述Sk核苷酸序列SEQ ID NO.40所示，含有该元件的载体能够等量地重组表达位于两端的基因，对实现家蚕多基因表达具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件及表达载体和应用
本专利技术属于生物
，涉及基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件，还涉及包含该元件的表达载体。
技术介绍
在家蚕体内高效地重组表达多个基因可以推动家蚕的基础与应用研究，例如研究多个基因之间的相互关系、重组表达多亚基蛋白复合物的基因、与荧光蛋白同时表达可视化地研究靶标基因在体内的移动以及培育能够抗家蚕质型多角体病毒与核型多角体病毒的家蚕品种等。得益于2000年家蚕转基因操作体系的建立，此前，在家蚕体内同时表达多个基因主要是通过遗传杂交来实现的。首先，必须先建立多个单一表达靶标基因的转基因家蚕品系，再杂交，最后在杂交后代中筛选同时表达多个外源基因的家蚕个体。例如2006年，TakahiroAdachi等人成功将家蚕脯酰羟基酶β-亚基与人胶原蛋白同时表达在家蚕后部丝腺；2009年，MasashiIizuka等人同时表达了鼠单克隆抗体的轻链基因与重链基因，将完整的鼠单克隆抗体表达在了家蚕茧壳；2015年，MinoruTada等人还利用Gal4/UAS系统，采用两轮杂交的方式在家蚕中部丝腺中重组表达了anti-CD20单克隆抗体。该方法不仅耗时长，而且杂交过程比较繁琐。2A裂解肽是一个在1991年于口蹄疫病毒中发现的、存在于两个蛋白(2A、2B)之间的寡肽，通常还有19-22个氨基酸。当核糖体到达2A的C端最后两个氨基酸甘氨酸与脯氨酸时，由于核糖体酰胺中心内部结构的改变导致无法翻译下游基因，此时，上游初生肽被水解释放出核糖体，然后核糖体再翻译下游基因，理论上可以实现两个基因的等量表达。目前，2A已经在多个细胞系、物种(小鼠，斑马鱼，猪，果蝇和羊种)中成功共表达了多个基因组合，应用于治疗癌症和其他疾病，或遗传改良具有特定功能或抗性植物和动物新品种。因此，前期研究中，我们也利用来至于猪肠病毒的P2A构建了家蚕丝腺2A多基因表达系统，但是，该系统并不能等量地重组表达位于2A上下游的DsRed基因与EGFP基因。Kozak序列(Kozakconsensussequence)是位于真核生物mRNA5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。1981年，女科学家KOZAK在研究真核生物中起始密码子AUG周边碱基定点突变后对靶标基因的转录和翻译所造成的影响时，首先总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：-G/N-C/N-C/N-ANNAUGG-，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的A、+4位的G对翻译效率非常重要。目前，诸多研究者也相继报道Kozak序列可以影响基因的表达水平。例如，2014年，通过将WNT16基因上游的调节序列(GCACCC)优化成为kozak序列(GCCACC)后，其表达量被提高了3.7倍，另外，GATA4基因上游Kozak序列-6位的G突变成C后，GATA4基因的表达量就被严重下调。但是将Kozak序列用于优化家蚕丝腺中2A多基因表达系统，使其能够等量地重组表达位于2A两端的基因未见报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件；本专利技术的目的之二在于提供含有所述基因元件的多基因表达载体；本专利技术的目的之三在于提供所述的多基因元件在等量表达多基因中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1.基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件，所述基因元件由Sk与2A裂解肽组成；所述2A裂解肽为家蚕质型多角体病毒的2A；所述Sk核苷酸序列SEQIDNO.40所示。优选的，所述家蚕质型多角体病毒的2A序列如SEQIDNO.37所示。2.含有所述基因元件的多基因表达载体。优选的，所述表达载体如SEQIDNO.35所示。3.所述的多基因元件在等量表达多基因中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件，通过利用Kozak序列优化家蚕丝腺中2A多基因表达系统，使其能够等量地重组表达位于2A两端的基因，为在家蚕丝腺与蚕丝中重组表达多个基因提供技术支持。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为在Sf9细胞中Ck通过提高下游基因的翻译效率增强其表达水平(A：瞬时表达载体结构图，k为根据kozak规则设计的序列；B：瞬时表达载体转染Sf9细胞后的荧光结果；标尺为400um；C：RT-PCR分析Sf9细胞中DsRed基因转录情况；D：转染后Sf9细胞中RFP的表达情况；D：转染后Sf9细胞中RFP的相对含量)。图2为在BmE细胞中Ck增强BmCPV2A(30)下游EGFP基因的表达水平(A：瞬时表达载体结构图；Sk为家蚕内源基因丝胶1基因N端的kozak序列；B：RT-PCR检测瞬时表达载体转染BmE细胞后融合基因的转录水平；C：瞬时表达载体转染Sf9细胞后的荧光结果，标尺为400um；D：转染后BmE细胞中RFP与EGFP表达情况；E与F分别为转染后BmE细胞中RFP、EGFP相对表达量分析。图3为Ck在转基因家蚕pR-CkG中部丝腺中介导DsRed与EGFP基因高效表达(A：转基因表达载体，红色箭头为RT-PCR引物；B：转基因家蚕pR-CkG中部丝腺中的荧光结果，标尺为2mm；C和D分别为RT-PCR检测融合基因DsRed-P2A-CkEGFP在正常家蚕与pR-CkG转基因家蚕中部丝腺中的转录情况；E：转基因家蚕pR-CkG中部丝腺中重组蛋白的检测。pR-CkG-1泳道中的总蛋白质浓度是pR-CkG-2中的1/2，是pR-CkG-3中的1/4，红色的五角星和绿色的五角星分别表示被成功断裂的RFP和EGFP蛋白；F转基因家蚕pR-CkG中部丝腺中重组蛋白RFP与EGFP的含量分析)。图4为转基因家蚕pCkG-CkR中高效表达DsRed基因与EGFP基因(A：转基因表达载体；B：阳性转基因家蚕蛾子的筛选；C与D：分别为RT-PCR检测融合基因CkG-CkR在正常家蚕与pCkG-CkR转基因家蚕中部丝腺中的转录情况；E：转基因家蚕pG-R、pCkG-CkR中部丝腺与茧壳中的荧光结果，标尺为2mm；F：转基因家蚕pG-R、pCkG-CkR茧壳中重组蛋白RFP与EGFP的检测：G：转基因家蚕pCkG-CkR茧壳中重组蛋白RFP与EGFP的含量分析。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本专利技术实施使用的材料如下：细胞系：斜纹夜蛾Sf9卵巢细胞系、家蚕胚胎BmE细胞。Sf9细胞和BmE细胞均使用含有10％胎牛血清(Gibco)的培养基(Gibco)培养；靶标基因：红色荧光蛋白基因(DsRed)、绿色荧光蛋白基因(EGFP)，以及融合基因DsRed-P2A-CkEGFP、CkEGFP-P2A-CkDsRed与EGFP-P2A-DsRed，均由金斯瑞公司合成；家蚕品系：非滞育品种D9L。一、瞬时表达载体与转基因表达载体的构建根据Kozak序列的设计规则：在AUG中的碱基A、U、G分别标为1、2、3位，(1)第4位的偏好碱基为G；(2)AUG的5’本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件，其特征在于：所述基因元件由Sk与2A裂解肽组成；所述2A裂解肽为家蚕质型多角体病毒的2A；所述Sk核苷酸序列SEQ ID NO.40所示。

【技术特征摘要】
1.基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件，其特征在于：所述基因元件由Sk与2A裂解肽组成；所述2A裂解肽为家蚕质型多角体病毒的2A；所述Sk核苷酸序列SEQIDNO.40所示。2.根据权利要求1所述基于2A裂解肽实现两个基因等量表达的多基因元件，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆友，王元成，王峰，田弛，侯凯，赵萍，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50