基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock‑in细胞系的方法，采用CRISPR/Cas9技术在基因组上SREBP1基因的3’端原位整合入T2A‑Luciferase报告基因，建立了SREBP1‑T2A‑Luciferase的knock‑in细胞系，并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对SREBP1有激活作用的转录因子LXRα对SREBP1‑T2A‑Luciferase细胞系进行转录激活，结果表明SREBP1‑T2A‑Luciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映细胞系内SREBP1分子表达水平。该细胞系的建立将有助于SREBP1基因功能研究及筛选影响SREBP1表达的小分子化学药物，为脂代谢及其相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

Establishment of a luciferase knock-in cell line based on CRISPR targeting genome modification technology

The present invention relates to a method for establishing a knock_in cell line of luciferase based on CRISPR-targeted genomic modification technique. The knock_in cell line of SREBP1_T2A_Luciferase was established by in situ integration of the 3'-terminal of SREBP1 gene into the T2A_Luciferase reporter gene on the genome using CRISPR/Cas9 technique, and the knock_in cell line of SREBP1_T2A_Luciferase was verified Site specific integration of foreign genes in the genome. At the same time, the transcriptional activation of SREBP1 T2A Luciferase cell line was performed by using the reported transcription factor LXRalpha. The results showed that the expression level of Luciferase in SREBP1 T2A Luciferase cell line could accurately and sensitively reflect the expression level of SREBP1 molecule in the cell line. The establishment of this cell line will be helpful to the functional study of SREBP1 gene and the screening of small molecule chemicals affecting the expression of SREBP1, and provide a new experimental idea and solution for lipid metabolism and related research.

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及利用CRISPR/Cas9介导的靶向基因组插入技术建立细胞系，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-Luciferase细胞系的新方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌长期演化形成的免疫防御系统，该系统是利用CRISPR-derivedRNA(crRNA)通过碱基配对与trans-activatingRNA结合形成复合物，Cas9内切酶在此复合物引导下对与crRNA配对的序列进行定点切割。所以，通过人工设计具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，可以引导Cas9对宿主细胞DNA进行定点切割，然后通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或同源重组(homologousrecombination，HR)两种修复途径的机制进行修复，实现基因编辑。目前检测基因的表达调控主要是通过RT-PCR、WesternBlot和将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中等手段来实现。RT-PCR过程繁琐且不稳定，WesternBlot抗体标记费时昂贵，这些都不利于高通量筛选；由于基因组本身存在表观遗传学修饰，将启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中的方法无法模拟基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因表达情况。随着今年来报告基因技术的不断发展，荧光蛋白报告基因、荧光素酶报告基因等已成为基础研究中常用的细胞标记与示踪的方法，由于其具有方便快捷、安全直观的优点，不仅普遍应用于探索构建分子通路的分子生物学实验，而且越来越广泛用于筛选药物所构建的细胞系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，利用CRISPR/Cas9技术，提供一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-Luciferase细胞系的新方法。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)在目的基因SREBP1的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；2)将检测过的打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；3)构建靶向SREBP1基因的打靶载体pUC19/SREBP1-donor，该打靶载体pUC19/SREBP1-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pADNA片段；4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/SREBP1-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系；5)克隆并构建SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV-LXRα，该表达载体pUC19/CMV-LXRα被用于SREBP1基因的转录激活实验研究；6)验证HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性SREBP1基因的相对表达量及表达变化；使用所构建的SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV-LXRα分别转染HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中SREBP1分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的SREBP1mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映SREBP1分子的相对表达变化。根据本专利技术，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA为针对SREBP1的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：sgRNA1序列为：GTCGAAGCTTTGAAGGCCGA；sgRNA2序列为：GATCTTGACCCTAAGACCGG；sgRNA3序列为：GTGGCCGATCGGGGCACTGC；sgRNA4序列为：GCTTTCCCGGACTGCAAGCA。进一步地，步骤4)中所述的HEK293细胞系为人胚肾细胞系HEK293。本专利技术的基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-Luciferase细胞系的新方法，具有如下优点：采用CRISPR/Cas9技术在基因组上SREBP1基因的3’端原位整合入T2A-Luciferase报告基因，建立了SREBP1-T2A-Luciferase的knock-in细胞系，并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对SREBP1有激活作用的转录因子LXRα对SREBP1-T2A-Luciferase细胞系进行转录激活，结果表明SREBP1-T2A-Luciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映细胞系内SREBP1分子表达水平。该细胞系的建立将有助于SREBP1基因功能研究及筛选影响SREBP1表达的小分子化学药物，为脂代谢及其相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。同时，通过在靶基因下游整合入报告基因来检测靶基因表达的方法也可广泛应用于其它各种基因的相关研究。附图说明图1是携带sgRNA及Cas9的表达载体结构示意图。图2是打靶Donor载体结构示意图。图3是所建立的KI-T2A-Luciferase细胞系的结构示意图。图4是细胞正负筛选稳定后倒置荧光显微镜下观察结果图，其中左图为白光图，右图为荧光图。图5是对细胞经有限稀释法进行克隆化后每个克隆的Luciferase活性检测图。图6是对有Luciferase活性的单克隆细胞PCR检测电泳图。图7是对SREBP1-T2A-Luciferase细胞克隆化后所得27号克隆的PCR产物中野生型大小条带和整合型大小条带分别进行胶回收测序结果。图8是转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV-LXRα转染HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系后Luciferase的检测结果。图9是转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV-LXRα转染野生型HEK293细胞系后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock‑in细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)在目的基因SREBP1的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6‑sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；2)将检测过的打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNAs‑SV40pA；3)构建靶向SREBP1基因的打靶载体pUC19/SREBP1‑donor，该打靶载体pUC19/SREBP1‑donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A‑Luciferase‑CMV‑eGFP‑T2A‑Neomycin‑SV40pA DNA片段；4)将pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNAs‑SV40pA与pUC19/SREBP1‑donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系；5)克隆并构建SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV‑LXRα，该表达载体pUC19/CMV‑LXRα被用于SREBP1基因的转录激活实验研究；6)验证HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性SREBP1基因的相对表达量及表达变化；使用所构建的SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV‑LXRα分别转染HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中SREBP1分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock‑in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的SREBP1 mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映SREBP1分子的相对表达变化。...

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)在目的基因SREBP1的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；2)将检测过的打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；3)构建靶向SREBP1基因的打靶载体pUC19/SREBP1-donor，该打靶载体pUC19/SREBP1-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pADNA片段；4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/SREBP1-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-SREBP1-T2A-luciferase-KI细胞系；5)克隆并构建SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV-LXRα，该表达载体pUC19/CMV-LXRα被用于SREBP1基因的转录激活实验研究；6)验证HEK293-SR...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏海滨，李子航，赵俊丽，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61