一种非转基因CRISPR突变体的制备方法技术

本发明专利技术提供一种基于CRISPR‑Cas9技术的非转基因突变体的制备方法，具体的，包括构建方法和筛选方法。构建方法为将CRISPR‑Cas9及sgRNA预组装，定位在农杆菌的T‑DNA，通过农杆菌侵染目标植物及共培养，CRISPR‑Cas9及sgRNA的序列不需要整合到目标植物基因组里，就可实现目标植物的目的基因定点改变，使得到的目的基因定点改变的突变体材料，不需要经过有性生殖和后代分离群体筛选等过程，也不含有任何外源基因序列。本发明专利技术提供的高通量测序与高分辨率熔解曲线技术对得到的再生苗进行筛选，能够在转基因当代高效、快速地从再生苗中鉴定得到目的基因发生突变的突变体植株，即使是对突变体比例为混合群体1/100的低比例突变体筛选，本发明专利技术的筛选方法仍可保证优异的准确性和灵敏度。

Preparation of a non transgenic CRISPR mutant

The present invention provides a preparation method of non-transgenic mutant based on CRISSPR_Cas9 technology, in particular, including a construction method and a screening method. The construction method is to pre-assemble the CRISPR_Cas9 and sgRNA and localize the T_DNA of Agrobacterium tumefaciens. Through Agrobacterium tumefaciens Infection and co-culture, the sequences of CRISPR_Cas9 and sgRNA can be changed without integration into the genome of the target plant. Mutant materials do not need to undergo sexual reproduction and screening of offspring, and do not contain any exogenous gene sequences. The high-throughput sequencing and high-resolution melting curve technology provided by the invention can screen the regenerated seedlings, and can identify the mutant plants with mutant gene mutation efficiently and quickly from the regenerated seedlings in the present transgenic era, even if the mutant proportion is 1/100 of the mixed population, the native mutant can be screened. The screening method still ensures excellent accuracy and sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种非转基因CRISPR突变体的制备方法
本专利技术属于现代分子育种
，涉及在不导入外源基因的前提下利用基因编辑技术构建及筛选作物突变体，具体为一种非转基因CRISPR突变体的制备方法。
技术介绍
转基因技术为作物改良提供了强大的工具。然而，公众对转基因作物中的外源基因及其表达可能引起的食品安全和基因漂移问题存在担忧，制约了转基因技术的应用。近年来，CRISPR-Cas9技术介导的基因组编辑迅猛发展，其精准和高效性使以其为基础的定点突变在作物改良方面具有巨大的应用潜力，甚至有望替代传统的转基因技术。目前植物中最广泛应用的CRISPR-Cas9技术依赖于Cas9核酸内切酶和sgRNA基因稳定整合到目标植物基因组中。对于单年生有性繁殖目标植物，稳定整合的外源基因(包括Cas9和sgRNA基因等)能够通过有性生殖和后代分离群体筛选实现与目标突变的分离，从而从基因组中清除出去，得到非转基因的突变子代。然而，有性生殖及后代群体筛选清除外源基因的方法不适用于通过无性繁殖的多年生植物。因为这些植物大多具有较长的童期，需要多年生长之后才能进行有性生殖；更重要的是，其基因组大多高度杂合，有性生殖将导致子代中重要优异性状的分离。因此，在依赖于无性繁殖的多年生杂交作物中，需要直接构建非转基因的CRISPR-Cas9突变体。已有研究表明，进入原生质体的预组装的CRISPR-Cas9核糖核蛋白能够引起目的基因突变，不需要CRISPR-Cas9基因稳定整合至目标植物基因组中。目前，通过基因枪的方法已成功将CRISPR-Cas9核糖核蛋白导入小麦和玉米细胞中，产生非转基因的突变体。然而，原生质体和基因枪的方法仅适用于少部分作物，很多作物无法通过原生质体实现整株植株的再生。大多数作物能够利用叶片、下胚轴、子叶、愈伤等外植体实现再生，通过农杆菌与外植体共培养已能够在很多多年生作物的细胞中实现农杆菌T-DNA基因的瞬时表达和蛋白合成。但是，将Cas9基因定位于农杆菌T-DNA区，能否成功在作物细胞中瞬时表达，并实现CRISPR-Cas9蛋白对目标作物基因的定点突变尚未见报道。另一方面，CRISPR-Cas9技术对目标作物基因的定点突变是由目标植物在修复Cas9剪切DNA位点时随机自动发生的，可以在目标区段内引起不同类型的基因突变，可能是删除少数几个核苷酸，也有可能导致增加少数核苷酸或是替换原有的核苷酸，不同独立株系的突变植株的情况不同。而大多数的基因突变在小苗期无法直观确定其表型变化，即无法通过表型判断是否为突变体植株。且由于希望得到的是外源基因没有整合到基因组上的植株，这类植株通常对抗生素没有抗性，无法使用抗生素进行筛选，导致获得的再生苗中既包含突变体植株，也包含没有发生突变的野生型植株。因此需要采用特定的方法进行筛选鉴别，从较大样本中将突变体植株筛选出来。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于CRISPR-Cas9技术的非转基因突变体的构建和筛选方法，使得到的目的基因定点改变的突变体材料，不需要经过有性生殖和后代分离群体筛选等过程，也不含有任何外源基因序列。一种非转基因CRISPR-Cas9突变体植株制备方法，所述制备方法包括以下步骤：S1：将含有1个内含子的Cas9基因连入CRISPR基础载体，得到具有内含子的CRISPR-Cas9载体；S2：根据目的基因，设计sgRNA靶定序列，并进一步连入启动子序列，合成具有启动子的sgRNA序列；S3：将S2所得的具有启动子的sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR-Cas9载体，得到预组装Cas9突变载体；S4：将S3得到的预组装Cas9突变载体转化农杆菌，将带有预组装Cas9突变载体的农杆菌侵染目标植物外植体，共培养；S5：将S4共培养后的外植体转移至适合再生且不添加抗生素的培养基上，在适用于目标植物的、农杆菌介导的遗传转化条件下，诱导目标植物愈伤和芽再生，得到若干株独立株系的再生苗；基于以上构建方法，由于预组装Cas9突变载体中CRISPR-Cas9及sgRNA定位在农杆菌的T-DNA，通过农杆菌侵染目标植物及共培养，CRISPR-Cas9及sgRNA的序列不需要整合到目标植物基因组里，就可实现目标植物的目的基因定点改变，即sgRNA引导CAS9到目标植物目的基因的靶定序列处，通过CAS9对该位置进行剪切，实现目的基因sgRNA靶定序列区域的序列被准确编辑，并且目标植物基因组中不一定含有外源基因序列。然而，由于希望得到的是基因组中不含有任何外源基因序列的植株，这类植株通常对抗生素没有抗性，因此在遗传转化过程中不能够使用抗生素进行筛选，导致获得的再生苗中既包含突变体植株，也包含没有发生突变的野生型植株。因此需要对构建产物进一步筛选和鉴定，以从制备所得到的大量独立株系的再生苗中，进一步筛选出目的基因sgRNA靶定序列区域的序列被准确编辑的植株。S6：将S5得到的独立株系的再生苗随机分成若干待测组，分别将各待测组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA，采用目的基因sgRNA靶定区域的特异性引物PCR扩增包含以sgRNA靶定位点为中心的上下游共80-120bp的区域，得到各待测组PCR产物样本；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA，并PCR扩增相同区域，得到野生组PCR产物样本，野生型植株叶片取样植株数无特殊限制；使用野生组PCR产物样本对各待测组PCR产物样本进行稀释，得到各待测组对应的稀释组PCR产物样本；S7：分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，使用BWA软件默认参数将测序所得序列定位至PCR扩增区域的野生型序列上；分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本每个位点处与野生型序列相同的核苷酸的比例，得到非变异核苷酸频率，变异核苷酸总频率则为1-非变异核苷酸频率；比较每个位点在待测组、其对应稀释组和野生组样本中的变异核苷酸总频率；若某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则表明该位点存在突变；若某一待测组PCR产物样本存在符合“待测组>>稀释组≥野生组”规律的位点，则表明该待测组含有目的基因发生突变的突变体植株，则该待测组为突变组；由于实际操作中，有些位点在高通量测序中错误率高，即表现为变异核苷酸频率高。这样的情况下，当待测组中所含独立株系再生苗超过40株时，采用现有的筛选方法，即仅对待测组测序，所得到的结果很可能是不含有突变体的待测组中也存在高频率的变异核苷酸，导致假阳性率高，筛选准确率非常不理想。本专利技术增加了稀释组这一设置，野生组和待测组中变异核苷酸频率都高的位点，稀释组其变异核苷酸频率不会下降；而只在突变体中存在的真实突变的变异核苷酸，因为在野生组中不存在，因此在稀释组中的频率就会大幅下降，以此去除本身测序错误率高的位点对真实突变位点的影响。以上步骤可从各待测组中筛选到具有真实突变体植株的突变组，在此基础上，进一步对筛选出的突变组进行高分辨率熔解曲线分析，以得到具体的突变植株，分辨率熔解曲线分析方法如下：S8：分别将S7筛选得到的突变组进一步分成若干待测亚组，分别将各待测亚组中每株再生苗取等量叶片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非转基因CRISPR‑Cas9突变体植株制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1：将含有1个内含子的Cas9基因连入CRISPR基础载体，得到具有内含子的CRISPR‑Cas9载体；S2：根据目的基因，设计sgRNA靶定序列，并进一步连入启动子序列，合成具有启动子的sgRNA序列；S3：将S2所得的具有启动子的sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR‑Cas9载体，得到预组装Cas9突变载体；S4：将S3得到的预组装Cas9突变载体转化农杆菌，将带有预组装Cas9突变载体的农杆菌侵染目标植物外植体，共培养；S5：将S4共培养后的外植体转移至适合再生且不添加抗生素的培养基上，在适用于目标植物的、农杆菌介导的遗传转化条件下，诱导目标植物愈伤和芽再生，得到若干株独立株系的再生苗；S6：将S5得到再生苗随机分成若干待测组，分别将各待测组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA，采用目的基因sgRNA靶定区域的特异性引物PCR扩增包含以sgRNA靶定位点为中心上下游共80‑120bp的区域，得到各待测组PCR产物样本；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA，并PCR扩增相同区域，得到野生组PCR产物样本；使用野生组PCR产物样本对各待测组PCR产物样本进行稀释，得到各待测组对应的稀释组PCR产物样本；S7：分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，使用BWA软件默认参数将测序所得序列定位至PCR扩增区域的野生型序列上；分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本每个位点处与野生型序列相同的核苷酸的比例，得到非变异核苷酸频率，变异核苷酸总频率则为1‑非变异核苷酸频率；比较每个位点在待测组PCR产物样本、其对应稀释组PCR产物样本和野生组PCR产物样本中的变异核苷酸总频率；若某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则表明该位点存在突变，若某一待测组PCR产物样本存在突变位点，则表明该待测组含有目的基因发生突变的突变体植株，则该待测组为突变组；S8：分别将S7筛选得到的突变组进一步分成若干待测亚组，分别将各待测亚组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA；对待测亚组与野生组使用同样的sgRNA靶定位点附近区域特异性引物在同样条件下进行高分辨率熔解曲线PCR，若待测亚组所得曲线与野生组明显分离，则为该待测亚组为突变亚组，所述明显分离为待测亚组所得曲线与野生组曲线在差异最大处的值统计检验P...

【技术特征摘要】
1.一种非转基因CRISPR-Cas9突变体植株制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1：将含有1个内含子的Cas9基因连入CRISPR基础载体，得到具有内含子的CRISPR-Cas9载体；S2：根据目的基因，设计sgRNA靶定序列，并进一步连入启动子序列，合成具有启动子的sgRNA序列；S3：将S2所得的具有启动子的sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR-Cas9载体，得到预组装Cas9突变载体；S4：将S3得到的预组装Cas9突变载体转化农杆菌，将带有预组装Cas9突变载体的农杆菌侵染目标植物外植体，共培养；S5：将S4共培养后的外植体转移至适合再生且不添加抗生素的培养基上，在适用于目标植物的、农杆菌介导的遗传转化条件下，诱导目标植物愈伤和芽再生，得到若干株独立株系的再生苗；S6：将S5得到再生苗随机分成若干待测组，分别将各待测组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA，采用目的基因sgRNA靶定区域的特异性引物PCR扩增包含以sgRNA靶定位点为中心上下游共80-120bp的区域，得到各待测组PCR产物样本；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA，并PCR扩增相同区域，得到野生组PCR产物样本；使用野生组PCR产物样本对各待测组PCR产物样本进行稀释，得到各待测组对应的稀释组PCR产物样本；S7：分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，使用BWA软件默认参数将测序所得序列定位至PCR扩增区域的野生型序列上；分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本每个位点处与野生型序列相同的核苷酸的比例，得到非变异核苷酸频率，变异核苷酸总频率则为1-非变异核苷酸频率；比较每个位点在待测组PCR产物样本、其对应稀释组PCR产物样本和野生组PCR产物样本中的变异核苷酸总频率；若某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则表明该位点存在突变，若某一待测组PCR产物样本存在突变位点，则表明该待测组含有目的基因发生突变的突变体植株，则该待测组为突变组；S8：分别将S7筛选得到的突变组进一步分成若干待测亚组，分别将各待测亚组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA；对待测亚组与野生组使用同样的sgRNA靶定位点附近区域特异性引物在同样条件下进行高分辨率熔解曲线PCR，若待测亚组所得曲线与野生组明显分离，则为该待测亚组为突变亚组，所述明显分离为待测亚组所得曲线与野生组曲线在差异最大处的值统计检验P<0.001；每组突变亚组的每个独立再生小苗分别与野生型小苗取等量叶片组织1:1混合，提取DNA，进行高分辨率熔解曲线PCR；若所得曲线与野生组有明显分离，则该独立再生小苗为目的基因发生突变的突变体植株；S9：取S8筛选得到的突变体植株的叶片组织，提取DNA，使用任意两对或两对以上定位于T-DNA插入片段的引物进行PCR扩增，以避免出现假阴性结果；并同时使用S3中预组装的PDS-Cas9突变载体DNA作为阳性对照。若阳性对照可扩增得到PCR产物，而突变体DNA两对或两对以上引物均无法得到扩增产物，则表明该突变体植株中很可能不含有外源基因序列，将该植株作为非转基因突变体候选植株；S10：将S9得到的非转基因突变体候选植株取样进行无性繁殖，对无性繁殖植株进行CRISPR-Cas9载体T-DNA区抗性基因的抗性筛选，若植株不具有抗性，则表明不含有外源基因序列，为非转基因CRISPR-Cas9突变体植株；S11：将S10鉴定得到的非转基因CRISPR-Cas9突变体植株转移至适宜的生根培养基，继续培养，得到非转基因CRISPR-Cas9突变体完整植株。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S6中所述各待测组植株数为50-100株。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S7中先分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本在Cas9剪切位点及其上下游共14-20bp区域内的位点的变异核苷酸总频率，所述Cas9剪切位点为sgRNA靶定位点3’端3-8个核苷酸区域；如该区域内所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则进一步统计整个PCR扩增共80-120bp区域。4.根据权利要求1至3任一条所述的制备方法，其特征在于，所述目标植物为烟草，所述目的基因为烟草PDS基因。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁静，陈龙正，李威，洛伦佐·卡廷格拉齐尼，李义，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32