一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法，本发明专利技术提供的方法可实现快速、灵敏、准确性高、简便、经济实惠地去鉴定同源性很高的基因在砧木和接穗间能否进行长距离传递，具有广阔的市场前景。该方法过程简单，要求不高，耗时短，工作量较小，工作周期较小，效率高，花费便宜，一方面可为科研者节约金钱，另一方面，缩短实验时间，提高工作效率，且具有应用的广泛性与普遍性，可以大范围在同属植物上应用，解决了一般实验室无法通过聚丙烯酰胺凝胶以及垂直电泳槽对同属植物砧木和接穗间同源性很高的基因进行RT‑PCR‑dCAPS鉴定的问题，省去了转基因所耗费的时间，而RT‑PCR‑CAPS对基因序列要求也高，一般基因难以满足。

A molecular identification method for the transfer of FT mRNA molecules between the rootstocks of the same plant

The invention relates to a molecular identification method for FT mRNA molecule transfer between rootstocks and Scions of the same genus plants. The method provided by the invention can realize rapid, sensitive, high accuracy, simple and economical identification of long-distance transmission of genes with high homology between rootstocks and scions, and has broad market prospects. This method has the advantages of simple process, low requirement, short time-consuming, small workload, small working cycle, high efficiency and low cost. On the one hand, it can save money for researchers, on the other hand, it can shorten the experimental time and improve the work efficiency. It has the universality and extensiveness of application and can be widely used in the same genus plants. It solved the problem that the general laboratory could not identify RT, PCR, dCAPS by the polyacrylamide gel and the vertical electrophoresis tank for the genes with high homology between rootstocks and Scions belonging to the same plant. The time spent on transgene was saved, while RT PCR CAPS CAPS had high requirement for gene sequence, and the general gene was difficult to satisfy.

【技术实现步骤摘要】
一种FTmRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法
本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是FT基因mRNA分子在梨属植物砧木和接穗间长距离传递的分子鉴定方法。
技术介绍
在果树生产上广泛运用嫁接技术，砧木与接穗相互作用会提高根系对营养元素的吸收运输、提高接穗抗逆、改善果实品质、增加果实产量，使接穗提早开花、调控接穗矮化等，到目前为止，砧穗间相互作用关系研究主要集中在解剖学、营养运输、激素及生理学特性等方面，有关分子机制研究较少。已经发现砧穗间存在一些RNA及蛋白质信号分子可以通过植物韧皮部进行长距离传递，进而影响砧木或接穗的生理和发育进程。目前主要在拟南芥、南瓜、番茄、马铃薯等草本植物中鉴定到一些可以进行长距离传递的内源mRNA及蛋白质信号分子，并且对分子机制进行了一定的研究，而木本植物果树虽然鉴定到了几种可以进行长距离传递的内源mRNA分子，其中发现PbWoxT1mRNA能够在伴胞中与PbPTB3形成RNP复合体进行长距离移动，可对树形发育、树势平衡进行调控，另外，将可传递的AtGAImRNA构建表达载体，利用转基因技术获得苹果转基因砧木，将接穗嫁接于转基因砧木上后，发现可使接穗矮化，因此可通过对果树砧穗间长距离传递mRNA分子进行鉴定和传递机理研究，利用转基因技术，培育具有特异功能砧木，通过嫁接定点改良砧木(或接穗)调控接穗(或砧木)重要农艺性状，提高经济效益，为果树育种及生产提供指导。FLOWERINGLOCUST(FT)mRNA利用构建携带特异性标签的载体对拟南芥突变体进行转基因，将野生型接穗嫁接于转基因砧木上后RT-PCR检测，可在接穗中发现砧木转基因的特异性条带，并且发现使接穗提早开花，证明了FTmRNA可以在植物砧穗间进行长距离传递。目前对于鉴定木本植物基因的mRNA是否能够进行长距离传递的方法，只有通过构建携带特异性标签的载体进行转基因嫁接后RT-PCR检测以及酶切扩增多态性(Cleavedamplifiedpolymorphicsequences,CAPS)技术。虽然这些技术检测基因的传递性比较准确，但是其中存在的缺点是过程繁琐，要求高，耗时长，工作量较大，工作周期长，效率低等，而在研究多年生木本植物mRNA在砧穗间传递的过程中，需克隆砧木和接穗的基因序列，通常同属植物砧穗间序列只存在几个碱基的差异，目前较为简便的方法是衍生酶切扩增多态性(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequence，dCAPS)技术，在引物中引入错配碱基构建限制性内切酶识别位点，即可通过酶切检测那些引起酶切位点发生改变的SNPs，达到区分砧穗间传递的不同基因序列的目的，但是这种方法仍然有其不足之处，因为同属植物砧穗基因差异产生的酶切产物大小只相差20bp左右，所以实施该方法需要采用聚丙烯酰胺凝胶以及昂贵的垂直电泳槽仪器，因此不利于一般实验室鉴定mRNA在植物砧穗间传递，这样就大大限制了所能鉴定可传递mRNA的数量，造成果树内源mRNA嫁接传递的研究进展缓慢，新的长距离传递的内源mRNA难以发现。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供的方法解决了一般实验室无法通过聚丙烯酰胺凝胶以及垂直电泳槽对同属植物砧木和接穗间同源性很高的基因进行RT-PCR-dCAPS鉴定的问题，同时也解决了果树转基因技术较难，耗时长而不方便鉴定，RT-PCR-CAPS对基因序列要求高，一般基因也难以满足的问题。本专利技术利用不同品种间基因序列中存在的SNPs(单核苷酸多态性)，通过设计特异的引物，引入错配碱基构建限制性内切酶识别位点，使得不同品种砧穗间基因序列原本不存在天然有差异的酶切位点进而获得了酶切位点，之后设计特异的一对长引物再次对上一轮PCR扩增产物进行巢式PCR扩增，最后使用限制性内切酶酶切，通过常规的水平电泳槽将酶切产物用琼脂糖凝胶进行分离，即可比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，鉴定mRNA在植物砧穗间是否传递，最终解决了同属植物砧木和接穗同源性很高的基因能否通过简单仪器与常规操作进行长距离传递鉴定的问题，具有快速、灵敏、准确性高、简便、经济实惠，能够应用于其他植物的特点。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：本专利技术提供的杜梨和鸭梨FT的核苷酸序列和由该核苷酸编码的蛋白的氨基酸序列，如SEQ1～4所示。一种FTmRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法，包括以下步骤：(1)根据https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中公布的金坠梨(GenBank:KF240775.1)中编码FT基因序列进行分析设计引物，分离和克隆鸭梨(Pyrusbretschneideri)、杜梨(PyrusbetulaefoliaBunge)中编码FT基因全长，利用生物信息学方法进行序列相似性分析，证实所得序列属于FT基因；(2)分析鸭梨和杜梨的FT基因序列，寻找两者基因差异的位点，在此位点的上下游分别设计特异性引物，以构成酶切位点；(3)鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接以及鸭梨自体微嫁接、杜梨自体微嫁接；(4)分别提取鸭梨自体嫁接、杜梨自体嫁接以及嫁接后砧木和接穗的总RNA，反转录成cDNA，用特异性引物第一轮PCR扩增得到各自FT基因片段；(5)回收第一轮PCR扩增产物FT的基因片段，以此为模板，再使用一对长引物进行第二轮PCR扩增，再次得到各自的FT基因片段；(6)用限制性内切酶对第二轮PCR回收产物进行酶切，比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，如果在嫁接体系中存在mRNA的双向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带，同样在砧木杜梨的扩增产物酶切后也会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果存在mRNA的单向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带或者在砧木杜梨的扩增产物酶切后会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果mRNA不发生传递，那么扩增产物的酶切电泳图中就会显示出各自相应样品的条带而无其他杂带；所述用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因的全长引物为：上游5’-ATGCCTCGGGACAGGGACC-3’下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；所述用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第一轮引物为：上游5’-GTTGTCCAGCAACCTAGAGTTGGTAC-3’下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；所述用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第二轮引物为：上游5’-CAATGGTTGTGAGCTCAAACCTTCTCAAGTTGTCCAGCAACCTAGAG-3’和下游5’-AATCCAAGGTTATAAAGCTCGGCGAAGTCTCTGGTATTGAAGTTTTGG-3’；所述的限制性内切酶为KpnI。在上述方案的基础上，用于提取总RNA的样品选择微嫁接30d后砧木杜梨茎段韧皮部和嫁接口以及接穗鸭梨茎段韧皮部。附图说明本专利技术有如下附图：图1所示为鸭梨和杜梨FT基因全长PCR扩增电泳图。图中：M：DNA分子量标准；1：鸭梨；2：杜梨。图2所示为FT氨基酸序列同源性比较图。图中：DL-FT为杜梨；YL-FT为鸭梨；JZ-FT为金坠梨。图3所示为FT基因序列同源性比较图。图中：DLFT为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杜梨FT基因，其核苷酸序列如SEQ 1所示。

【技术特征摘要】
1.一种杜梨FT基因，其核苷酸序列如SEQ1所示。2.由权利要求1所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ2所示。3.一种鸭梨FT基因，其核苷酸序列如SEQ3所示。4.由权利要求3所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ4所示。5.一种FTmRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据金坠梨中编码FT基因序列进行分析设计引物，分离和克隆鸭梨、杜梨中编码FT基因全长，利用生物信息学方法进行序列相似性分析，证实所得序列属于FT基因；(2)分析鸭梨和杜梨的FT基因序列，寻找两者基因差异的位点，在此位点的上下游分别设计特异性引物，以构成酶切位点；(3)鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接以及鸭梨自体微嫁接、杜梨自体微嫁接；(4)分别提取鸭梨自体嫁接、杜梨自体嫁接以及嫁接后砧木和接穗的总RNA，反转录成cDNA，用特异性引物第一轮PCR扩增得到各自FT基因片段；(5)回收第一轮PCR扩增产物FT的基因片段，以此为模板，再使用一对长引物进行第二轮PCR扩增，再次得到各自的FT基因片段；(6)用限制性内切酶对第二轮PCR回收产物进行酶切，比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，如果在嫁接体系中存在mRNA的双向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带，同样在砧木...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，郝理，王胜男，王圣元，徐超然，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11