一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒。唾液中hsa‑miR‑544a、hsa‑miR‑4726和hsa‑miR‑154‑3p联合诊断LSCC的准确率为96.88％(93/96)；唾液中hsa‑miR‑544a、hsa‑miR‑4726和hsa‑miR‑655‑5p联合诊断LSCC的准确率为92.71％(89/96)；唾液中hsa‑miR‑544a、hsa‑miR‑4726和hsa‑miR‑552‑3p联合诊断LSCC的准确率为95.83％(92/96)，诊断准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒
本专利技术属于基因检测领域，涉及一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒。
技术介绍
头颈癌是全世界第六大常见肿瘤类型，其中喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，而喉鳞状细胞癌(laryngealsquamouscellcarcinoma,LSCC)是喉癌中最常见的组织学类型(约85％～90％)。随着医学的发展，喉癌的治疗方式也越来越多，但喉癌的死亡率并没有明显改善，其主要原因是目前缺乏简单适用的筛查方法。微小RNA(microRNA,miRNA)是指长度约22个核苷酸的内源性微小非编码RNA，是多种生物学过程的有效调节子。对miRNA的研究表明：miRNA参与了人体细胞内多种重要的调节过程。其中miRNAs与肿瘤发生、发展的关系已成为目前研究的热点。近年来，有关miRNA在LSCC诊断及转移等方面的研究层出不穷，已有多项研究发现LSCC患者的组织和血液(包括血清和血浆)中有特别的miRNA表达谱，并能提示LSCC的诊断。目前尚无有效早期诊断喉鳞状细胞癌的基因检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术不足，提供一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：试剂盒1：一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，含有检测唾液中hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-154-3p的引物；其中，hsa-miR-544a的特异正向引物序列如Seq.NO.1所示，hsa-miR-4726的特异正向引物序列如Seq.NO.2所示，hsa-miR-154-3p的特异正向引物序列如Seq.NO.3所示，各基因的通用反向引物序列如Seq.NO.7所示。进一步地，还含有检测内参Cel-miRNA-39的引物，其特异正向引物序列如Seq.NO.6所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。进一步地，还含有RT-PCR所需的酶和试剂等。试剂盒2：一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，含有检测唾液中hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-655-5p的引物；其中，hsa-miR-544a的特异正向引物序列如Seq.NO.1所示，hsa-miR-4726的特异正向引物序列如Seq.NO.2所示，hsa-miR-655-5p的特异正向引物序列如Seq.NO.4所示，各基因的通用反向引物序列如Seq.NO.7所示。进一步地，还含有检测内参Cel-miRNA-39的引物，其特异正向引物序列如Seq.NO.6所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。进一步地，还含有RT-PCR所需的酶和试剂等。试剂盒3：一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，含有检测唾液中hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-552-3p的引物；其中，hsa-miR-544a的特异正向引物序列如Seq.NO.1所示，hsa-miR-4726的特异正向引物序列如Seq.NO.2所示，hsa-miR-552-3p的特异正向引物序列如Seq.NO.5所示，各基因的通用反向引物序列如Seq.NO.7所示。进一步地，还含有检测内参Cel-miRNA-39的引物，其特异正向引物序列如Seq.NO.6所示。当然，也可以使用其他常用的内参基因作为内参。进一步地，还含有RT-PCR所需的酶和试剂等。有益效果：唾液中hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-154-3p联合诊断LSCC的准确率为96.88％(93/96)；唾液中hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-655-5p联合诊断LSCC的准确率为92.71％(89/96)；唾液中hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-552-3p联合诊断LSCC的准确率为95.83％(92/96)。附图说明图1为hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-154-3p联合诊断LSCC的ROC曲线；图2为hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-655-5p联合诊断LSCC的ROC曲线；图3为hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-552-3p联合诊断LSCC的ROC曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。实施例1：miRNA标志物对LSCC诊断效能的初步验证一、实验对象本研究纳入2015年6月～2017年6月江苏省人民医院75例经WHO病理组织学确诊的初诊LSCC患者。有其他肿瘤或急性感染的LSCC患者被排除。患者中男性45例，女性30例。同时纳入75例江苏省人民医院健康体检中心进行体检的年龄、性别相匹配的健康人作为对照，其中男性45例，女性30例，年龄与LSCC患者无统计学差异。二、实验方法1、唾液收集唾液收集前，所有患者和健康人需禁食、禁饮至少2h。使用50ml无菌无酶离心管收集5ml自然流出的唾液，30min内收集完。唾液收集完后，4℃、2000g离心8min取上层上清液至1.5mlEP管，再以4℃、16000g离心10min后再弃沉淀取上清液，将所获上清液以每管250μl分装后置-80℃保存。从采集唾液到-80℃冻存的过程在2h内完成。2、总RNA提取及cDNA合成提取试剂为德国Qiagen公司的血清/血浆miRNA提取试剂(miRNeasySerum/Plasma)试剂盒。按照说明书，取解冻的唾液上清液200μl，加入1000μl裂解液(QIAzolLysisReagent)，剧烈震荡后室温下(15℃～25℃)放置5min；加入3.5μlQiagen公司的血清/血浆纯化试剂盒外参(miRNeasySerum/PlasmaSpike-InControl)(cel-39)作为外参，混匀，再加200μl氯仿，剧烈摇动15s，室温保存2～3min；4℃、12000g离心15min；吸上层无色水相，移入另一EP管中(约400μl)；加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；吸700μl样品到抽提微量RNA(RNeasyMinElute)离心柱中；10000g，室温离心15s，弃去收集管中的液体；分别用700μl缓冲液RWT、缓冲液RPE、80％乙醇洗脱后，总RNA结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去；最后加入14μl无酶水将离心柱上的RNA洗脱下来。使用分光光度计检测评价所提取总RNA的质量，总RNA的OD260/OD280值在1.8～2.1之间为合格的RNA样品，说明样品RNA制备较纯，无蛋白质污染，样品可进行下一步操作。取12μl提取的合格的RNA以Qiagen公司的miRNA反转录(miScriptRT试剂盒)进行反转录，该试剂采用poly(A)聚合酶多腺苷酰化成熟miRNA，并利用反转录酶及oligo-dT引物扩增将其转变为cDNA。按照试剂盒说明操作如下：加入2μlmiRNA反转录混合物(miScriptReverseTranscriptaseMix)(一种经优化的poly(A)聚合酶和反转录酶混合物)、2μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，其特征在于：含有检测唾液中hsa‑miR‑544a、hsa‑miR‑4726和hsa‑miR‑655‑5p的引物；其中，hsa‑miR‑544a的特异正向引物序列如Seq.NO.1所示，hsa‑miR‑4726的特异正向引物序列如Seq.NO.2所示，hsa‑miR‑655‑5p的特异正向引物序列如Seq.NO.4所示，各基因的通用反向引物序列如Seq.NO.7所示。

【技术特征摘要】
1.一种早期诊断喉鳞状细胞癌的唾液基因检测试剂盒，其特征在于：含有检测唾液中hsa-miR-544a、hsa-miR-4726和hsa-miR-655-5p的引物；其中，hsa-miR-544a的特异正向引物序列如Seq.NO.1所示，hsa-miR-4726的特异正向引物序列如Seq.NO.2所示，hsa-miR-...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛孝锦，邱长友，罗彬瑞，
申请(专利权)人：葛孝锦，
类型：发明
国别省市：江苏,32