一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法，该方法包括：取新鲜水牛乳，经脱脂、沉淀和纯化处理后，得到水牛乳酪蛋白；将水牛乳酪蛋白溶解到缓冲溶液中，煮沸变性，再向缓冲溶液中加入嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶进行酶解，酶解结束后煮沸灭酶，得到水牛乳酪蛋白酶解液；所述水牛乳酪蛋白酶解液依次经离心、超滤和纳滤处理后，冷冻干燥，得到水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽粉。本发明专利技术从鲜水牛乳中分离、纯化得到水牛乳酪蛋白，并采用嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶酶解水牛乳酪蛋白，经进一步分离纯化后，得到氮回收率高、分子量小、抗氧化活性强的水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽粉。

【技术实现步骤摘要】
一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法
本专利技术涉及乳制品
，尤其涉及一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法。
技术介绍
乳源生物活性肽是指在多种来源乳蛋白中天然存在的或在其被蛋白酶降解过程中得到的具有不同生理活性的多肽。随着多种具有不同生物活性的乳源肽不断被发现，乳蛋白已成为生理学界、营养学界以及食品学界研究的新热点。乳源活性肽具有抗氧化、调节机体免疫力、降高血压、抗肿瘤、调节代谢综合征等多种生理功能，其中抗氧化活性肽是被研究的较广泛的一个方向。虽然合成抗氧化剂具有高效和成本低的优点，但其潜在的副作用也备受争议，因此现代消费者更青睐于选择天然抗氧化剂。酪蛋白是乳品工业的主要产品之一，是干酪的主要组成，其含量占乳总蛋白含量的80％左右。对牛乳酪蛋白中抗氧化活性肽的制备和结构研究已经比较成熟，例如：公开号为CN102787156A的专利技术专利申请公开了牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g～40g，加水500mL，调节反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；(2)加碱性蛋白酶水解：吸取250μL～500μL酶液，维持反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，反应1～4小时；(3)灭活碱性蛋白酶，升温至80℃～100℃，维持15～30分钟；(4)沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.1～4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；(5)离心：4000g～10000g离心力，离心5～30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；(6)超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；(7)喷雾干燥：取步骤(6)中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。然而，目前关于水牛乳蛋白中抗氧化活性肽的释放研究还比较少。水牛乳是世界第二大乳，其产量约占全球乳产量的13％，并且中国是水牛乳产量大国。我国水牛乳与其他哺乳动物的乳相比，蛋白含量高达4.3％，是普通荷斯坦牛乳的1.5倍，其中必需氨基酸含量高达30.29％，这为制备优质乳源活性肽提供了原料保障。因此，研究利用水牛乳蛋白，研发制备水牛乳蛋白抗氧化肽有着重要的经济意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法，采用该方法制备获得的酪蛋白短肽不仅氮回收率高，分子量低，而且抗氧化活性也强，对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均较高。具体技术方案如下：一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法，包括：(1)取新鲜水牛乳，经脱脂、沉淀和纯化处理后，得到水牛乳酪蛋白；(2)将水牛乳酪蛋白溶解到缓冲溶液中，煮沸变性，再向缓冲溶液中加入嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶进行酶解，酶解结束后煮沸灭酶，得到水牛乳酪蛋白酶解液；(3)所述水牛乳酪蛋白酶解液依次经离心、超滤和纳滤处理后，冷冻干燥，得到水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽粉。所述嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶为THERMOASEC100蛋白酶，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)Var.Rokko，购自天野酶制剂有限公司。实验发现，THERMOASEC100蛋白酶可以在较高温度下高效水解疏水性氨基酸，获得抗氧化能力强的多肽。适宜的离心条件可以高效脱除脂肪，提高所得水牛乳酪蛋白的纯度。作为优选，步骤(1)中，所述脱脂的温度为3～6℃，转速为3500～5000r/min，时间为10～15min。作为优选，步骤(2)中，所述缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液，缓冲溶液中水牛乳酪蛋白的质量分数为2～5％。该磷酸缓冲液可以快速溶解酪蛋白，并直接调节溶液至最适酶解pH范围内，省去后续调节pH的步骤。作为优选，步骤(2)中，所述煮沸变性的温度为90～100℃，时间为5～10min。高温可以破坏蛋白质的立体结构，暴露出肽链，利于蛋白酶酶切，明显提高酶切效率。蛋白酶的添加量对氮回收率和酪蛋白抗氧化活性肽的分子量大小和抗氧化性能均有影响。作为优选，步骤(2)中，以1g酪蛋白计，缓冲溶液中所述嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶的添加量为0.005～0.020g。作为优选，步骤(2)中，所述酶解的温度为55～70℃，时间为2～4h。该酶解条件可以高效发挥蛋白酶酶活，提高多肽得率。作为优选，步骤(3)中，所述离心的转速为6000～8000r/min，时间为10～20min；可以尽可能分离多肽和不溶性蛋白，提高多肽得率。作为优选，步骤(3)中，所述超滤的截留量为6000～10000Da，压力为0.4～0.6MPa；所述纳滤的截留量为100～200Da，压力为2～2.5MPa。超滤可以除去少数残留脂质和大分子蛋白和多肽，纳滤可以除去小分子盐分，两个过滤步骤可以有效除去杂质，获得清澈纯净肽液，提高产品的抗氧化性能。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术从鲜水牛乳中分离、纯化得到水牛乳酪蛋白，并采用嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶酶解水牛乳酪蛋白，经进一步分离纯化后，得到氮回收率高、分子量小、抗氧化活性强的水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽粉。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本专利技术的保护范围不仅限于此。下列实施例中涉及的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、氮回收率和分子量分布的测定方法如下：(1)DPPH自由基清除率的测定：①在5mL离心管中分别加入0.1mL纯水和1.9mLDPPH无水乙醇溶液(1mmoL/L)，摇匀后于暗处反应30min后，用紫外分光光度计检测其515nm下的吸光值Ac；②在5mL离心管中分别加入0.1mL待测多肽液(2mg/mL)和1.9mLDPPH无水乙醇溶液(1mmoL/L)，摇匀后于暗处反应30min后，用紫外分光光度计检测其515nm下的吸光值Ai；③DPPH清除率用以下公式计算结果：(2)ABTS自由基清除率的测定：①ABTS自由基制备：将440μL浓度为140mmoL/L的过硫酸钾溶液加入到25mL浓度为7mmoL/L的ABTS溶液中，混匀避光反应12h后定容至100mL得ABTS自由基反应液。②在5mL离心管中分别加入0.1mL纯水和1.9mLABTS反应溶液(2mmoL/L)，混合摇匀反应10min后用紫外分光光度计检测其734nm下的吸光值A0；③在5mL离心管中分别加入0.1mL待测多肽液(2mg/mL)和1.9mLABTS反应溶液，混合摇匀反应10min后用紫外分光光度计检测其734nm下的吸光值A1；④ABTS清除率用以下公式计算结果：(3)氮回收率测定：通过凯氏定氮法分别测定水牛乳酪蛋白和肽粉中的氮百分含量分别为N1和N2。氮回收率通过下式计算：(4)小分子量肽含量测定：利用GEAKTApure蛋白纯化仪，配备SuperdexPeptide10/300GL色谱柱，流动相为含0.1％(V/V)TFA的30％(V/V)乙腈溶液，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。配制2mg/mL的多肽溶液，过0.22μm水系滤膜后进样100μL。分子量标准品选用抑肽酶(6511Da)、杆菌肽(1422Da)、还原型谷胱甘肽(614Da)和酪氨酸(181Da)。肽粉的分子量分布在200本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法，其特征在于，包括：(1)取新鲜水牛乳，经脱脂、沉淀和纯化处理后，得到水牛乳酪蛋白；(2)将水牛乳酪蛋白溶解到缓冲溶液中，煮沸变性，再向缓冲溶液中加入嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶进行酶解，酶解结束后煮沸灭酶，得到水牛乳酪蛋白酶解液；(3)所述水牛乳酪蛋白酶解液依次经离心、超滤和纳滤处理后，冷冻干燥，得到水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽粉。

【技术特征摘要】
1.一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备方法，其特征在于，包括：(1)取新鲜水牛乳，经脱脂、沉淀和纯化处理后，得到水牛乳酪蛋白；(2)将水牛乳酪蛋白溶解到缓冲溶液中，煮沸变性，再向缓冲溶液中加入嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶进行酶解，酶解结束后煮沸灭酶，得到水牛乳酪蛋白酶解液；(3)所述水牛乳酪蛋白酶解液依次经离心、超滤和纳滤处理后，冷冻干燥，得到水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽粉。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶为THERMOASEC100蛋白酶，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)Var.Rokko。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述脱脂的温度为3～6℃，转速为3500～5000r/min，时间为10～15min。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，步婷婷，吴建平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33