一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，其特征在于采用以下步骤：A、取新鲜的猪动脉血管，清净、沥干、绞碎；B、按一定质量比依次在氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液、乙醚中浸泡；C、使用蒸馏水反复洗涤、沥干后在乙酸水溶液浸泡3天，然后离心冷冻，得弹力蛋白粗品；D、将弹力蛋白粗品和去离子水混合后作为酶解底物，用NaOH调pH至8.0‑9.0，加入磷酸盐缓冲液，然后再加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，室温下采用超声辅助酶解，得初步酶解液；E、将所述初步酶解液，在红外线辐射下辅助酶解；灭酶后得酶解液；F、离心处理，取上清液，用超滤膜进行恒体积超滤，得超滤液；G、冷冻干燥，得弹力蛋白肽。本发明专利技术具有成本低、酶解效率高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法
本专利技术属于生物化工
，特别涉及一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法。
技术介绍
弹力蛋白是一种结构巨大、高交叉度、复杂的、疏水性、水不溶性的蛋白，作为一种主要的细胞外基质蛋白，组成了弹性纤维的“芯”。现已发现弹力蛋白有两种形式：弹力蛋白I存在于韧带、主动脉和皮肤中，弹力蛋白II可从软骨中得到。弹力蛋白是肌肤组成的重要成分，在肌肤中仅含5%，却是激发肌肤胶原蛋白和弹性纤维生成的关键，胶原蛋白决定肌肤的柔润饱满，弹性纤维决定肌肤的紧致弹力。弹力蛋白肽（elastin-derivedpeptides,EDPs）是弹力蛋白的降解产物。弹力蛋白的降解包括生物酶的降解和化学降解，前者一般称为弹力蛋白溶解，后者称为弹力蛋白肽的合成。弹力蛋白肽对纤维母细胞和单核细胞产生趋化作用，使弹性纤维与纤维母细胞的黏附力增强，弹力蛋白肽可刺激Neu-1唾液酸酶的活性增强，Neu-1的活性增强可引起可溶性的弹力蛋白地释放，这些弹力蛋白聚集成团，或和微纤维成分相互作用，形成弹性纤维，因而可提高皮肤的弹力，对于预防、改善皱纹或松弛十分有效。猪动脉血管来源丰富、廉价易得，含有丰富的弹力蛋白I，是获得弹力蛋白肽的优质且性价比较高的原料，但是现有技术中未见通过酶解反应方法以猪动脉血管为原料制备弹力蛋白肽的报道。目前制备弹力蛋白肽分为三种方法：化学方法、重组DNA合成、酶解弹力蛋白。通过化学方法合成的弹力蛋白肽成本一般较高，并且其副产物可能对人体有害，同时生产过程中会产生污染环境的排出物；通过重组DNA合成的弹力蛋白肽普遍为长肽，而弹力蛋白肽一般都是短肽，因此这种方法不适合制备弹力蛋白肽；酶解弹力蛋白制备弹力蛋白肽时，不仅降解所耗的时间短、操作简单安全、产品营养流失较少，而且不污染环境。酶解反应在常规水浴中进行时，需要较长的反应时间；在酸、碱及有机溶剂等介质中进行时，易使酶蛋白变性失活，酶解效率降低。超声辅助酶解，由于热效应、机械效应、空化效应和化学效应等共同作用，细胞壁会产生位移和变形，出现纵向裂纹、吸水润胀、细纤维化等现象，这些物理变化能让酶在水解时，有效地提高其可及度，提高酶解效率。红外线辅助酶解，对反应体系进行升温并促进蛋白酶切位点的暴露，可有效增加酶切位点与酶的作用频率，从而提升酶解效率，继而显著提高蛋白水解度和肽的转化率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，该方便具有成本低，酶解效率高的优点。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案，一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，其特征在于采用以下步骤：A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在1-5℃、2500-4500r·min-1条件下离心10-30min，得弹力蛋白粗品；D、按质量比1：20-100称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH至8.0-9.0，加入pH为8.0-9.0的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为1-5：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的1-5%；室温下采用超声辅助酶解，超声波功率100-400W，时间5-15min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP-1型；E、将所述初步酶解液，在功率为50-400W、波长为5-20μm的红外线辐射下继续辅助酶解3-10min；当所述初步酶解液温度升至40-60℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在80-100℃环境下灭酶处理5-15min，得酶解液；F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；G、将所述超滤液在-80℃、-2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。本专利技术制备的弹力蛋白肽可作为抗皱活性物应用于抗皱类护肤品中。本专利技术所述基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）为MMP-1型，市售产品有美国PeproTech公司的MMP-1型基质金属蛋白酶。MMP-1基质金属蛋白酶可直接作用猪动脉血管中I型弹力蛋白a1链上-Gly-Ala-间和a2链上-Gly-Leu-间使其发生断键，从而使螺旋结构降解为短肽。所述弹力蛋白酶，CAS号39445-21-1，市售产品有德国Merck公司的弹力蛋白酶。本专利技术通过采用弹力蛋白酶活化基质金属蛋白酶，进而加速弹力蛋白的降解，提高降解速度，提升基质金属蛋白酶的酶解效率。以下为本专利技术所制备弹力蛋白肽分子量测定的说明：通过Waters600高效液相色谱仪测量实施例1所制备弹力蛋白肽水溶液的分子量分布，色谱柱是TSKgel2000SWXL300mm×7.8nm。吸取2mL样品于容量瓶中，用流动相乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0.1）定容，微孔过滤膜过滤后进样，柱温为30℃，流速为0.5mL/min，在220nm下检测。结果显示，98.6%的弹力蛋白肽分子量小于10kDa。以下为本专利技术所制备弹力蛋白肽中氨基酸组成分析的说明：精确称取实施例1所制备的弹力蛋白肽，上氨基酸自动分析仪对其主要氨基酸组分进行分析，结果如表1所示。表1弹力蛋白肽中氨基酸组成氨基酸种类弹力蛋白肽中氨基酸组成mol/1000mol苏氨酸61丝氨酸34谷氨酸33甘氨酸403丙氨酸120缬氨酸60胱氨酸1蛋氨酸6天冬氨酸20亮氨酸35异亮氨酸12酪氨酸36苯丙氨酸30组氨酸3赖氨酸10精氨酸10羟脯氨酸8脯氨酸100以下为本专利技术促进透明质酸生成实验的说明：分别以人类纤维芽细胞和人体重组模型为研究对象，使用人类纤维芽细胞和人体重组模型以及分别含有0、1、5μg/mL实施例1制备的弹力蛋白肽培养基培养24小时，使用ELISA法（透明质酸测试试剂盒）测定培养基中分泌出的透明质酸量，将不含弹力蛋白肽条件下透明质酸生成量设为100%，计算弹力蛋白肽对透明质酸生成的促进率，实验结果如图1所示。由图可知，人类纤维芽细胞以及人体重组模型试验的结果都可以看出本专利技术制备的弹力蛋白肽对透明质酸的生成有较好的促进作用，从而淡化皮肤皱纹、提升皮肤弹性。以下为本专利技术促进细胞增殖实验的说明：人体皮肤纤维芽细胞投入含有0、0.05、0.1μg/mL实施例1制备的弹力蛋白肽培养基，培养24小时，测试生细胞数，将不含弹力蛋白肽条件下生细胞数设为100%，计算细胞增殖促进率，实验结果如图2所示。由图可知，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，其特征在于采用以下步骤：A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L‑1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L‑1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L‑1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在1‑5℃、2500‑4500r·min‑1条件下离心10‑30min，得弹力蛋白粗品；D、按质量比1：20‑100称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1 mol·L‑1的NaOH水溶液调节所述酶解底物pH至8.0‑9.0，加入pH为8.0‑9.0的磷酸盐缓冲液，然后向所述酶解底物中加入弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶，所述弹力蛋白酶与基质金属蛋白酶的质量比为1‑5：1，所述弹力蛋白酶和基质金属蛋白酶的总质量占酶解底物质量的1‑5%；室温下采用超声辅助酶解，超声波功率100‑400W，时间5‑15min，得初步酶解液；所述基质金属蛋白酶为MMP‑1型；E、将所述初步酶解液，在功率为50‑400W、波长为5‑20μm的红外线辐射下继续辅助酶解3‑10min；当所述初步酶解液温度升至40‑60℃时，关闭红外线，酶解完毕；然后在80‑100℃环境下灭酶处理5‑15min，得酶解液；F、将所述酶解液在12000r/min下离心15min，取上清液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜，在超滤压力为0.2MPa，超滤温度40℃的条件下进行恒体积超滤，加水量为酶解液体积的3倍，得超滤液；G、将所述超滤液在‑80℃、‑2Pa条件下冷冻干燥，得弹力蛋白肽。...

【技术特征摘要】
1.一种酶解猪动脉血管制备弹力蛋白肽的方法，其特征在于采用以下步骤：A、取新鲜的猪动脉血管，清洗干净后，沥干，用绞肉机绞碎，得碎猪动脉血管；B、按质量比1：20称取所述碎猪动脉血管和0.1mol·L-1的氢氧化钠水溶液，所述碎猪动脉血管在所述氢氧化钠水溶液中浸泡24h，捞出后用蒸馏水洗至中性；然后用碎猪动脉血管质量20倍的0.6mol·L-1的盐酸水溶液浸泡24h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，捞出后再次使用碎猪动脉血管质量2倍的乙醚浸泡24h，得预处理的猪动脉血管；C、将所述预处理的猪动脉血管使用蒸馏水反复洗涤，沥干后用等质量的0.5mol·L-1的乙酸水溶液浸泡3天，然后采用高速冷冻离心机，在1-5℃、2500-4500r·min-1条件下离心10-30min，得弹力蛋白粗品；D、按质量比1：20-100称取所述弹力蛋白粗品和去离子水，混合后作为酶解底物，用1mol·L-1的NaOH水溶液调节所述酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳娟，蒋丽刚，毕天宇，邱玉想，徐思伟，席长洪，
申请(专利权)人：珀莱雅化妆品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33