L-叔亮氨酸的生物转化方法技术

本发明专利技术公开了一种L‑叔亮氨酸的生物转化方法，包括以下步骤：以三甲基丙酮酸钠为底物，以辅酶NAD+和固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶为生物催化剂，添加铵盐建立转化体系进行生物转化反应，得到含有L‑叔亮氨酸的转化液。本发明专利技术利用固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶为生物催化剂，能够重复利用10次仍具有酶活，昂贵的辅酶和酶可以循环利用，节省生产成本；以自制的三甲基丙酮酸钠溶液为底物，简化了制备工艺，节省了生产成本，便于纯化；制备的L‑叔亮氨酸晶体纯度达到98.5％以上，光学纯度为99％以上。工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。利用HPLC‑MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。

【技术实现步骤摘要】
L-叔亮氨酸的生物转化方法
本专利技术涉及非天然氨基酸的制备方法，具体地指一种L-叔亮氨酸的生物转化方法。
技术介绍
非天然氨基酸及其衍生物是重要的化工中间体，其中，L-叔亮氨酸是一种重要的非天然氨基酸，可用于合成医药中间体，及作为不对称合成的手性诱导剂和不对称拆分的拆分试剂，广泛用于合成生物抑制剂、生物活性肽、抗癌和抗病毒等药物。目前已有施贵宝、辉瑞、雅培等制药公司上市的蛋白酶抑制剂类抗HIV新药都用L-叔亮氨酸作为中间体，如抗HIV药物阿扎那韦(Atazanavir)，其2006年全球销售额达到32.26亿美元，另外有六种正在临床试验的抗HIV抗肿瘤新药也用L-叔亮氨酸作为中间体。随着我国社会经济的发展和环境保护意识的增强，医药化工行业不但需要提高L-叔亮氨酸的生产能力，而且需要创造绿色无污染的生产工艺。因此，利用酶法进行生物转化生产L-叔亮氨酸正越来越受到相关机构的重视。现有技术中，L-叔亮氨酸的合成方法非常多，包括物理法，化学合成或拆分法，以及生物酶合成或拆分法。物理法是采用模拟移动床色谱分离技术分离N-乙酰-DL-叔亮氨酸消旋体，其确定是需要专业设备投资大，固定相昂贵，流动相消耗大，分离条件需要优化确定。化学合成主要有以手性原料如(R)-叔丁基甘氨醇和(R)-4-苯基-2-唑烷酮等经过多步合成得到L-叔亮氨酸，该合成方法手性起始原料昂贵，污染物排放多，产品收率不高。另一种化学合成方法是不对称合成，采用手性诱导剂如(R)-苯基甘氨酸酰胺或手性a-苯乙胺分别与特戊醛或叔丁基酮酸反应合成L-叔亮氨酸，但不对称合成需要用到的催化剂价格昂贵，污染严重且不适合大规模生产。也可用化学拆分的方法合成L-叔亮氨酸，报道的手性拆分剂有10-樟脑磺酸，光学纯酒石酸，光学纯扁桃酸等，存在的缺点是手性拆分剂昂贵，无效对映体需分离及消旋，收率不高，有机溶剂用量大。由于生物催化技术具有很强的底物专一性、较高的催化效率、温和的反应条件以及对环境污染较小等优点，已被广泛用于制备L-叔亮氨酸。通过生物催化合成L-叔亮氨酸主要包括两大类方法，即利用酶拆分光学活性叔亮氨酸以制备L-叔亮氨酸的方法和生物催化直接合成L-叔亮氨酸的方法。例如：申请号为200610020854的中国专利技术专利申请利用米曲霉氨基酰化酶以及申请号为201010138158中国专利技术专利申请利用一种双酶体系(酰化氨基酸消旋酶和水解酶)都能拆分叔亮氨酸消旋体，制备高光学纯度的L-叔亮氨酸(光学纯度达99％ee值以上)。虽然这两种方法的生产成本适中，便于工业化生产，整个生产过程也较简单，但是，L-叔亮氨酸的理论得率低于50％。利用生物催化手段直接合成L-叔亮氨酸额方法，能提高L-叔亮氨酸的得率。目前生物法的主要研究方向均集中于利用L-亮氨酸脱氢酶从三甲基丙酮酸还原为L-叔亮氨酸的路线，并利用甲酸脱氢酶原位再生辅酶NADH，利用甲酸铵提供氨分子和氢原子。早在上世纪九十年代德国的Degussa公司就利用该路线与超滤膜反应器结合，生产L-叔亮氨酸。该路线已经有数个专利申请公开，其存在的主要问题有：目前公开的专利中，反应起始底物浓度为10-15％，而L-叔亮氨酸脱氢酶在底物浓度过高时会受到显著的底物抑制，反应速率急速下降，在高氨浓度的条件下，过量的底物和生成的产物积累都会形成副产物，说明该方法难以重复。另外，酶投料量过多，昂贵的辅酶NAD投料量达到底物的1％(w/w)，经济性差，且无明确的后提取工艺，依然无法满足工业化生产的需要。因此，研发一种高效的L-叔亮氨酸的生物转化方法显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题就是要提供一种L-叔亮氨酸的生物转化方法，该方法在保证高立体选择性、高转化率和高得率的基础上，能有效提高底物浓度，减少辅酶投入，简化生产工艺和降低生产成本。为解决上述技术问题，本专利技术所提供的L-叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶；2)以二氯频呐酮为原料制备三甲基丙酮酸钠溶液；其化学反应式如下所示：制备三甲基丙酮酸钠溶液具体包括如下步骤：a.向反应釜中加入1重量份的二氯频呐酮和2重量份的水，边搅拌边滴加10mol/L的氢氧化钠溶液，调pH至10-11，滴完升温至75度，反应至溶液清亮透明，冷却；b.将步骤a所得的溶液加热至40℃，加入0.8重量份的高锰酸钾，在加高锰酸钾的过程中，温度升温至83℃，反应两小时，冷却，静置，过滤，滤渣用水充分洗涤后与滤液合并得到无色透明溶液，即为三甲基丙酮酸钠溶液。3)以步骤2)所得的三甲基丙酮酸钠溶液为底物，以辅酶NAD+和步骤1)所得的固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶为生物催化剂，添加铵盐建立转化体系进行生物转化反应，得到含有L-叔亮氨酸的转化液。优选地，步骤1)中，用卡拉胶或复配胶将亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶固定，得到固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶。进一步地，复配胶由海藻酸盐与聚乙二醇的混合物，所述海藻酸盐为海藻酸钙、海藻酸钾、海藻酸钠中的一种或几种，所述海藻酸盐与聚乙二醇的重量比为1:4-9。更进一步地，海藻酸盐与聚乙二醇的重量比为1:4，所述海藻酸盐由海藻酸钙、海藻酸钾、海藻酸钠按重量比为3:9:4组成。更进一步地，用卡拉胶或复配胶将亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶固定，包括以下步骤：将卡拉胶或复配胶在蒸馏水中加热溶解，降温后加入亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶，搅拌均匀，再降温至其凝固，即得固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶。更进一步地，卡拉胶或复配胶与蒸馏水的重量比为1:6-10，将卡拉胶或复配胶在蒸馏水中加热至80-90℃溶解，降温至35-45℃后加入亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶，所述固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶中，亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、卡拉胶的质量比为1:4-6:7-12，所述固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶切成1×1cm3的立方体备用。更进一步地，步骤3)中，所述铵盐为甲酸铵；甲酸铵与三甲基丙酮酸钠的摩尔比控制为1.8-2.2:1，优选为2:1；所述固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和三甲基丙酮酸钠的用量比为8-12g:1mol，优选为10g:1mol，辅酶NAD+与三甲基丙酮酸钠的用量比为0.2-0.4g:1mol，优选为0.3g:1mol，三甲基丙酮酸钠在转化体系中的终浓度控制为2mol/L，转化体系的pH值控制为5-10，优选为6，控制所述转化体系的温度为20-60℃，优选为55℃；；控制转化时间为12-36小时，优选为25小时；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为150-250r/min，优选为200r/min。再更进一步地，将含有L-叔亮氨酸的转化液浓缩后置于0-4℃中放置8-16h，结晶，得到L-叔亮氨酸粗晶体；将L-叔亮氨酸粗晶体用甲醇冲洗，抽滤，再次结晶，得到L-叔亮氨酸晶体。作为另一种实施方案，将含有L-叔亮氨酸的转化液先用732型强酸性阳离子交换树脂吸附，再用201型强碱性阴离子交换树脂吸附，得到L-叔亮氨酸晶体。这样，可以提高L-叔亮氨酸的收率和纯度。亮氨酸脱氢酶为购买的来源于蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的亮氨酸脱氢酶。甲酸脱氢酶为购买的来自博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)的甲酸脱氢酶。本专利技术的优点主本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L‑叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶；2)以二氯频呐酮为原料制备三甲基丙酮酸钠溶液；3)以步骤2)所得的三甲基丙酮酸钠溶液为底物，以辅酶NAD+和步骤1)所得的固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶为生物催化剂，添加铵盐建立转化体系进行生物转化反应，得到含有L‑叔亮氨酸的转化液。

【技术特征摘要】
1.一种L-叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶；2)以二氯频呐酮为原料制备三甲基丙酮酸钠溶液；3)以步骤2)所得的三甲基丙酮酸钠溶液为底物，以辅酶NAD+和步骤1)所得的固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶为生物催化剂，添加铵盐建立转化体系进行生物转化反应，得到含有L-叔亮氨酸的转化液。2.根据权利要求1所述的L-叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，所述步骤1)中，用卡拉胶或复配胶将亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶固定，得到固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶。3.根据权利要求2所述的L-叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，所述复配胶由海藻酸盐与聚乙二醇的混合物，所述海藻酸盐为海藻酸钙、海藻酸钾、海藻酸钠中的一种或几种，所述海藻酸盐与聚乙二醇的重量比为1:4-9。4.根据权利要求3所述的L-叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，所述海藻酸盐与聚乙二醇的重量比为1:4，所述海藻酸盐由海藻酸钙、海藻酸钾、海藻酸钠按重量比为3:9:4组成。5.根据权利要求2所述的L-叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，用卡拉胶或复配胶将亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶固定，包括以下步骤：将卡拉胶或复配胶在蒸馏水中加热溶解，降温后加入亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶，搅拌均匀，再降温至其凝固，即得固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶。6.根据权利要求5所述的L-叔亮氨酸的生物转化方法，其特征在于，所述卡拉胶或复配胶与蒸馏水的重量比为1:6-10，将卡拉胶或复配胶在蒸馏水中加热至80-90℃溶解，降温至35-45℃后加入亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶，所述固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶中，亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、卡拉胶的质量比为1:4-6:7-12，所述固定化的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶切成1×1...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡磊，潘崇德，陈迈，陈建华，
申请(专利权)人：南宁信肽生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广西,45