一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是在白色PVC底板上依次相互交错2mm粘贴上NC膜、标记了fPSA抗体和鼠抗兔IgG的荧光微球结合物垫、样品垫、吸水垫，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条组装而成的测试卡，NC膜上预包有fPSA抗体检测线和兔IgG质控线，本发明专利技术将时间分辨荧光免疫层析技术引入到了血液中fPSA的定量检测中，不仅大大的节约了检测时间，提升了检测的稳定性和灵敏度，而且操作简便，可用于现场筛查；同时也具有成本便宜，性价比高的优点。

A time resolved fluoroimmunochromatographic assay strip for quantitative detection of fPSA in blood and its preparation method

The invention relates to a time-resolved fluorescence immunochromatographic strip for quantitative detection of fPSA in blood and a preparation method thereof. The test strip was assembled on a white PVC substrate by interlacing two mm NC film, labeling fPSA antibody and mouse anti-rabbit IgG fluorescent microsphere conjugate pad, sample pad and water absorbent pad, and then fixing the test strip with two matching plastic jackets. The test strip was pre-coated with fPSA antibody detection line and rabbit IgG quality. The invention introduces the time-resolved fluorescence immunochromatography technology into the quantitative detection of fPSA in blood, which not only greatly reduces the detection time, improves the stability and sensitivity of the detection, but also is easy to operate and can be used for on-site screening; at the same time, it has the advantages of low cost and high cost performance.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法
本专利技术属于医学检验领域，特别是涉及一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法。
技术介绍
游离前列腺特异性抗原（freeProstateSpecificAntigen,fPSA）在血液中小部分以游离形式存在，未与α1糜蛋白结合的PSA片段。正常人约80％的t-PSA以结合形式存在，f-PSA约占20％。PSA仅由前列腺上皮细胞分泌，具有很高的组织特异性，在前列腺癌（ProstateCancer,PCA）患者血清中可明显升高，但对其诊断的特异性并不高，良性前列腺增生（BenignProstateHyperplasia,BPH）、前列腺息肉、前列腺缺血、细菌性前列腺炎等都可轻度升高。目前，国内通常把TPSA>4ng/ml作为筛选前列腺癌的临界值，把TPSA结果在4～10ng/ml之间称为灰色区域，前列腺癌与前列腺增生均有可能，而当TPSA>10ng/ml时，前列腺癌可能性极大。对于f-PSA/TPSA比值，各文献报道不一致，有以0.16为标准的，也有以0.19或0.25等为临界值，当血清TPSA在灰色区域时，f-PSA/TPSA显得非常重要，f-PSA/TPSA大于临界值时，前列腺癌可能性小，当f-PSA/TPSA值小于临界值时，前列腺癌可能性较大。目前的血液中fPSA的诊断技术主要包括：酶联免疫实验（ELISA）、化学发光（CLIA）、胶体金免疫层析等方法，但这些方法都有各自的特点及不足：ELISA和化学发光以及时间分辨荧光法原理类似，只在灵敏度方面有差异，目前大都实现了自动化、大批量、定量检测，但是存在方法间结果差异大，线性范围较窄等缺点，另外，自动化检测目前由国外大厂商所垄断，仪器设备昂贵，并且不适合单人份和较小批量检测用，大大限制了它们在基层医院、诊所的应用，近年来出现了胶体金免疫层析法来检测总fPSA，快速，便捷，单人份操作，但是缺点是只能实现半定量，只能指示一个大概范围，无法实现精确定量，而且因为胶体金灵敏度的限制，无法检测血液中含量低的游离的fPSA，异常标本需要使用其他方法复核检测，无形中增加了被测试者的就医成本，在市场推广方面有较大难度，很难大面积使用。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是在传统荧光分析的基础上创立的一种新型非放射性免疫分析技术。TRFIA以含有镧系稀土元素的纳米微球作为标记物的，根据镧系金属螯合物荧光持续时间长且Stokes位移大，用时间分辨技术测量荧光，有效排除非特异性荧光的干扰，具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等特点。与经典的时间分辨荧光免疫分析方法DELFIA法不同，时间分辨荧光免疫层析技术采用荧光纳米微球作为标记物，每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了标记效率，有效的提高了灵敏度；同时纳米荧光微球表面修饰有合适密度的羧基，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高标记物的稳定性。随着科技的发展，即时诊断领域中的免疫层析技术，从第一代胶体金、彩色乳胶到第二代荧光微球技术，实现了从定性到定量分析的飞跃。而时间分辨荧光免疫层析技术则更进一步，提升了检测的稳定性和灵敏度，而且操作简便，检测时间短，可用于现场筛查；同时也具有成本便宜，性价比高的优点。时间分辨荧光免疫层析是以乳胶微球标记抗体进行免疫反应检测标本中的生物活性物质，通过检测荧光纳米微球发出的荧光强度来提供对生物样品的定量检测数据，采用标记的免疫复合物-荧光强度的标准曲线，从而计算出待测生物样品的量。目前常用的标记乳胶微球为荧光纳米微球，没有特定波长紫外光的照射情况下不会激发荧光，只有在特定波长的紫外灯照射下才会发出荧光，商品化荧光纳米微球都经过了表面的修饰，大大方便了标记的过程，标记简便，重复性好。
技术实现思路
本专利技术的目的即是将时间分辨荧光免疫层析技术应用在fPSA定量检测试纸条中，将fPSA抗体和兔IgG分别共价偶联于荧光纳米微球上，二者按比例混合之后作为检测线和质控线，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的干式荧光免疫分析仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大缩短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的种种弊端，又综合了前述几种方法的优势：可以单人间检测，也可以批量检测，并且可以即时给出准确的定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。为达到上述的目的，本专利技术的技术方案如下：一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条，该测试卡包括底板7和底板7上依次紧密连接的样品垫1、荧光微球结合物垫2、反应膜3和吸水垫6。其中底板为PVC底板；荧光微球结合物垫上包被有fPSA抗体和鼠抗兔IgG抗体；反应膜为硝酸维生素（NC）膜，NC膜上设有检测线4和质控线5；检测线4上包被有fPSA抗体，质控线5上包被有兔IgG。。其中所述结合物垫是经过结合物垫处理液预处理的玻璃纤维，所述的结合物垫处理液是含有0.1mg/mL的M004阻断剂，1％的硼酸，0.5％的BSA和3％海藻糖的硼酸盐缓冲液。在本专利技术的实施方案中，所述样品垫1、荧光微球结合物垫2、反应膜3和吸水垫6在底板7按顺序排列，其中，所述样本垫1与所述荧光微球结合物垫2部分重合，重合部分长度占所述荧光微球结合物垫2长度的1/5～1/3；所述荧光微球结合物垫2与反应膜3有部分重合，重合部分长度占所述荧光微球结合物垫2长度的1/5～1/3；所述反应膜3与吸水垫6有部分重合，重合部分长度占所述荧光微球结合物垫2长度的1/10～1/5；所述检测线4和质控线5的长度占所述反应膜3长度的1/15～1/10；所述检测线4和样本垫1的距离占所述反应膜3长度的1/4～1/3；所述检测线4和质控线5之间的间距占所述反应膜的1/3～1/2。在本专利技术的一个具体实施例中，样本垫1的长度为20mm，荧光微球结合物垫2的长度为6mm，样本垫1与荧光微球结合物垫重合2mm；反应膜3的长度为25mm，反应膜3与荧光微球结合物垫重合2mm；吸水垫6的长度为17mm，吸水垫6和反应膜3的重合2mm；检测线4距离样本垫7mm，检测线和质控线的宽度为2mm，两者相距6mm。在本专利技术的一个实施例中，所述fPSA抗体的终浓度为0.05～0.5mg/mL。在本专利技术的一个优选实施例中，所述fPSA抗体的终浓度为0.1～0.3mg/mL。在本专利技术的一个最优选实施例中，所述fPSA抗体的终浓度为0.2mg/mL。在本专利技术的一个实施例中，所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度为0.05～0.5mg/mL。在本专利技术的一个优选实施例中，所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度为0.1～0.3mg/mL。在本专利技术的一个更优选实施例中，所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度0.2mg/mL。在本专利技术的一个实施例中，所述荧光微球的直径为50～500nm。在本专利技术的一个优选实施例中，所述荧光微球的直径为100～300nm。在本专利技术的一个更优选实施例中，所述荧光微球的直径为200nm。在本专利技术的一个实施全中，所述荧光微球载有镧系元素或其螯合物，所述镧系元素优选为钐、铕或铽。本专利技术还提供上述任一种时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：A、结合物垫的处理：用定量喷液装置将结合物垫处理液以16μL/c本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括PVC底板，底板上依次相互交错2mm粘贴上NC膜、标记了fPSA抗体和鼠抗兔IgG的荧光微球结合物垫、样品垫、吸水垫，所述NC膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有fPSA抗体，所述质控线上包被有兔IgG，所述检测条用配套的上下两个塑料卡壳固定。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括PVC底板，底板上依次相互交错2mm粘贴上NC膜、标记了fPSA抗体和鼠抗兔IgG的荧光微球结合物垫、样品垫、吸水垫，所述NC膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有fPSA抗体，所述质控线上包被有兔IgG，所述检测条用配套的上下两个塑料卡壳固定。2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫、荧光微球结合物垫、反应膜和吸水垫在底板按顺序排列。3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述fPSA抗体的终浓度为0.2mg/mL；所述鼠抗兔IgG抗体的终浓度为0.2mg/mL。4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球的直径为200nm。5.根据权利要求1-4任一所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球载有镧系元素或其螯合物，所述镧系元素优选为钐、铕或铽。6.根据权利要求1-5任一所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、结合物垫的处理：用定量喷液装置将结合物垫处理液以16μL/cm的量喷涂于结合物垫上后45℃烘干24小时；B、NC膜的制备：使用包被缓冲液分别将抗fPSA包被抗体以及兔IgG稀释到0.8mg/mL和1.0mg/mL浓度，使用定量喷液装置分别将两者以0.5-0.8cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，后于45℃烘干72小时，加入干燥剂封存备用；C、结合物垫的制备：选用直径为200nm的乳胶微球，使用碳二亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐盛，刘小平，夏琳，常文伟，
申请(专利权)人：深圳市迈科龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44