一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法技术

本发明专利技术提供一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，该方法包括以下步骤：(1)采用体积比1‑1.3％EMS磷酸缓冲液对冬瓜种子处理10‑15h获得M1代种子；(2)将用EMS诱变剂处理过的M1代冬瓜种子置于氧气浓度为10‑15％的25‑30℃的CO2恒温催芽箱中催芽；(3)M1代种子播种，自交后获得M2代种子；然后M2代种子播种，自交授粉15‑25d后，采用大田过茎基部淹水15‑25cm处理3h‑4h，挑选耐涝冬瓜株系，将耐涝株系进行单瓜收种留种，获得耐涝冬瓜突变体株系Mut。本发明专利技术采用化学诱变剂EMS对冬瓜种子进行诱变处理，获得冬瓜耐涝突变体，扩大了种质资源来源，创制出新的种质资源。

A method of using EMS mutagens to create watermelon mutants of wax gourd

The invention provides a method for creating waterlogging tolerant mutant of wax gourd by using EMS mutagen. The method comprises the following steps: (1) the seeds of wax gourd were treated with EMS phosphoric acid buffer with a volume ratio of 1.3% for 10 15 h to obtain M1 seeds; (2) the seeds of wax gourd treated with EMS mutagen were placed at 25 30 C with an oxygen concentration of 10 15%. (3) M1 seeds were sown and M2 seeds were obtained after self-pollination; then M2 seeds were sown and self-pollinated for 15 25 days. After 15 25 cm flooding treatment for 3 4 hours in the field, waterlogging tolerant winter melon lines were selected, and waterlogging tolerant winter melon mutants Mut was obtained. . The invention adopts chemical mutagen EMS to mutagenize wax gourd seeds, obtains waterlogging-tolerant mutants of wax gourd, enlarges the source of germplasm resources, and creates new germplasm resources.

【技术实现步骤摘要】
一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法
本专利技术涉及冬瓜种质资源创制
，特别地，涉及一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法。
技术介绍
冬瓜是我国主要蔬菜作物，年播种面积约480万亩，冬瓜产品对于调节我国蔬菜周年供应发挥着重要作用。由于冬瓜主要分布在我国、印度、越南、老挝等东南亚国家，然而，相对于其他蔬菜作物，冬瓜材料遗传背景较窄，严重的限制了冬瓜新材料的创制和优质资源的扩大选育。目前，冬瓜缺少耐涝种质资源，而冬瓜主要种植区域在长江流域及以南地区，在种植过程中经常遭遇洪涝灾害，造成巨大的经济损失，而目前通过现有的种质资源大田筛选很难获得抗涝冬瓜种质资源，冬瓜生产中遇到的洪涝灾害问题未能很好解决。化学诱变剂EMS(ethylmethanesulfonate甲基磺酸乙酯)是一种单功能烷化剂，是植物诱变中最常用的高效化学诱变剂之一，由于其在体内可以转变成缺电子的活泼中间产物，容易与碱基上的N原子和磷酸基团发生亲核取代反应，使DNA结构改变，因此被广泛用作优质作物新材料创制的化学诱变剂。EMS化学诱变技术已经在甜瓜、小麦、水稻、玉米、西瓜、黄瓜等多种作物上取得理想的诱变效果，获得了一些基因型改变的作物，对作物功能基因组学研究和新品种创制及扩大选育起着重要的推动作用。创建突变体库筛选突变体可以为冬瓜育种提供新的种质材料，从而推进冬瓜种质创新，但目前还未见冬瓜相关的突变体库构建工作，因此开展冬瓜EMS突变体诱变及耐涝突变体筛选具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，以解决现有技术中冬瓜缺少耐涝种质资源的技术问题。为实现上述目的，本专利技术提供了一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，包括以下步骤：(1)采用EMS诱变剂对冬瓜种子进行处理，具体为：挑选健康饱满的冬瓜种子，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于50-60℃的温汤中浸种25-40min；浸种后置于25-30℃恒温箱催芽30-40h；然后用体积比1-1.3％EMS磷酸缓冲液处理10-15h，用终止液终止反应；浸泡结束后，用清水冲洗10-15h；(2)种植处理的种子：将EMS诱变剂处理过的冬瓜种子置于氧气体积浓度为10-15％的25-30℃的CO2恒温催芽箱中催芽，挑选发芽的种子进行育苗床播种；(3)突变体获得，具体为：首先，M1代的种植和种子采收：将经过诱变处理的种子标为M1，筛选催芽后穴盘育苗，自交授粉；将M1代各个单株分别收获，单瓜留种，获得M2代种子；其次，M2代的种植和选择：将M2代种子在氧气体积浓度为10-15％的25-30℃CO2恒温催芽箱中催芽，挑选萌发种子播种于试验田中；然后，自交授粉，待座果进行过茎基部淹水处理，挑选耐涝冬瓜株系，将耐涝株系进行单瓜收种留种，获得耐涝冬瓜突变体种子Mut。进一步地，步骤(1)中，所述冬瓜种子在浸种过程中需要不停搅拌使种子受热均匀。进一步地，步骤(1)中，将冬瓜种子用体积比1.2％EMS磷酸缓冲液处理12h。进一步地，所述EMS溶液的配置为使用PH为7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液配置体积浓度为1.2％的EMS溶液。进一步地，所述终止剂为质量浓度5％的Na2S2O3溶液。进一步地，步骤(3)中，所述冬瓜M2代种植后，自交授粉，待座果15-25d采用大田过茎基部淹水15-25cm处理3-4h，挑选出耐涝冬瓜株系。进一步地，所述冬瓜种子为健康饱满的高代自交系冬瓜种子。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，用化学诱变剂EMS对冬瓜高代自交系种子进行诱变处理，获得突变体库，扩大了种质资源来源，创制出新的种质资源。其中，采用体积比1.2％的EMS磷酸缓冲液处理冬瓜种子12h，是冬瓜的半数处理剂量，可获得最大的诱变率，达到54.67％的发芽率和51.83％的成苗率。本方法简单，诱变效果显著。本专利技术提供了一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，采用突变体种子催芽阶段低氧筛选，即将冬瓜种子置于氧气体积浓度为10-15％的25-30℃的CO2恒温催芽箱中催芽，可获得耐涝能力增强突变体，通过M2代大田淹水筛选出耐涝冬瓜突变株系Mut。通过对突变型Mut和野生型WT冬瓜苗期不同淹水时间下的不定根萌发数量、长度、净光合速率和存活率进行对比以及对其叶片进行过氧化氢酶、过氧化物酶、丙二醛、乙醇脱氢酶及羟自由基去除能力等差异分析，结果表明使用本专利技术方法诱变和筛选出的冬瓜突变体相对于野生型WT的冬瓜种子具有明显较强的的耐涝能力。本专利技术提供的一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，为冬瓜育种提供新的种质材料，从而推进冬瓜种质创新。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本专利技术还有其它的目的、特征和优点。下面将对本专利技术作进一步详细的说明。具体实施方式以下对本专利技术的实施例进行详细说明，但是本专利技术可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。本专利技术提供了一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，包括以下步骤：(1)EMS诱变最佳条件筛选在开展EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体之前，首先对EMS诱变处理条件和方式进行了对比实验，首先挑选健康饱满的DZ163冬瓜高代自交系种子，在诱变前，根据冬瓜萌发规律(冬瓜催芽需36h左右开始露白，72h左右萌发)，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于55℃的温汤中浸种30min，浸种过程中需要不停搅拌使种子受热均匀；浸种后置于28℃恒温箱催芽36h。然后，进行不同EMS浓度和时间处理。每种处理选取种子100粒。结果详见表1。表1EMS处理浓度和处理时间对冬瓜发芽率和成苗率的影响从表1中可以看出：随着EMS处理浓度及处理时间的增加，冬瓜种子发芽率及成苗率均呈下降趋势，其中浓度对冬瓜种子发芽率及成苗率的影响比处理时间的影响更明显。按照半数致死率的选取原则，选用最佳EMS处理条件为EMS浓度1.2％，处理时间12h，在该处理条件下可获得54.67％的发芽率和51.83％的成苗率。(2)采用EMS诱变剂对冬瓜种子进行处理，具体为：挑选健康饱满的DZ163冬瓜种子，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于55℃的温汤中浸种30min，浸种过程中需要不停搅拌使种子受热均匀，浸种后置于28℃恒温箱催芽36h；用PH为7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液配置体积比为1.2％的EMS溶液，然后用1.2％EMS磷酸缓冲液选择处理12h，用质量浓度为5％的Na2S2O3溶液终止反应；浸泡结束后，用清水冲洗12h。(3)种植处理的种子：将EMS诱变剂处理过的冬瓜种子置于置于氧气体积浓度为12％的28℃的CO2恒温催芽箱中催芽，及时在催芽盒中补充无菌水，保证冬瓜种子正常萌发。(4)突变体获得，具体为：首先，M1代的种植和种子采收：将经过诱变处理的种子(标记为M1)，穴盘育苗，定植于网室大棚内，自交授粉；将M1代各个单株分别收获，单瓜留种，获得M2代种子。其次，M2代的种植和选择：将M2代种子按M1代同样的种植方式在氧气体积浓度为12％的28℃CO2恒温催芽箱中催芽，挑选萌发种子播种于试验田中；然后，自交授粉，待座果20d采用大田过茎基部20cm淹水处理2h，确保水位基本淹没所有冬瓜植株茎基部，挑选耐涝冬瓜株系，将耐涝株系进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用EMS诱变剂对冬瓜种子进行处理，具体为：挑选健康饱满的冬瓜种子，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于50‑60℃的温汤中浸种25‑40min；浸种后置于25‑30℃恒温箱催芽30‑40h；然后用体积比1‑1.3％EMS磷酸缓冲液处理10‑15h，用终止液终止反应；浸泡结束后，用清水冲洗10‑15h；(2)种植处理的种子：将EMS诱变剂处理过的冬瓜种子置于氧气体积浓度为10‑15％的25‑30℃的CO2恒温催芽箱中催芽，挑选发芽的种子进行育苗床播种；(3)突变体获得，具体为：首先，M1代的种植和种子采收：将经过诱变处理的种子标为M1，筛选催芽后穴盘育苗，自交授粉；将M1代各个单株分别收获，单瓜留种，获得M2代种子；其次，M2代的种植和选择：将M2代种子在氧气体积浓度为10‑15％的25‑30℃CO2恒温催芽箱中催芽，挑选萌发种子播种于试验田中；然后，自交授粉，待座果进行过茎基部淹水处理，挑选耐涝冬瓜株系，将耐涝株系进行单瓜收种留种，获得耐涝冬瓜突变体种子Mut。

【技术特征摘要】
1.一种采用EMS诱变剂创制冬瓜耐涝突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用EMS诱变剂对冬瓜种子进行处理，具体为：挑选健康饱满的冬瓜种子，用清水冲洗冬瓜种子后，将其放置于50-60℃的温汤中浸种25-40min；浸种后置于25-30℃恒温箱催芽30-40h；然后用体积比1-1.3％EMS磷酸缓冲液处理10-15h，用终止液终止反应；浸泡结束后，用清水冲洗10-15h；(2)种植处理的种子：将EMS诱变剂处理过的冬瓜种子置于氧气体积浓度为10-15％的25-30℃的CO2恒温催芽箱中催芽，挑选发芽的种子进行育苗床播种；(3)突变体获得，具体为：首先，M1代的种植和种子采收：将经过诱变处理的种子标为M1，筛选催芽后穴盘育苗，自交授粉；将M1代各个单株分别收获，单瓜留种，获得M2代种子；其次，M2代的种植和选择：将M2代种子在氧气体积浓度为10-15％的25-30℃CO2恒温催芽箱中催芽，挑选萌发种子播种于试验田中；然后，自交授粉，待座果进行过茎基部淹水处理，挑选耐涝冬瓜株系，将耐涝株系进行单瓜收种留种，获得耐涝冬瓜突变体种子Mut...

【专利技术属性】
技术研发人员：弭宝彬，周火强，谢玲玲，武芳芳，戴雄泽，张竹青，
申请(专利权)人：湖南省蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43